Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Ответ в Как валидировать очистку от ДНК рекомбинантного белка

Иконка сообщения*  [ Без иконки ]   Важно!   Вопрос   Информация     Обмен опытом   Шутка, забавная история     Поздравления, благодарности   Возмутительно!   Проблема   Картинки, фотографии
Введите имя

 [вст. закрывающие теги*

*


*



Смайлик: согласен Смайлик: не согласен Смайлик: улыбка Смайлик: пожалуйста, умоляю! Смайлик: помираю со смеху Смайлик: подмигивание Смайлик: подшучивать, дразнить Смайлик: смущение Смайлик: мне стыдно Смайлик: жуть! Смайлик: не понял Смайлик: закатывать глаза Смайлик: недовольство, огорчение Смайлик: рёв в три ручья Смайлик: злость Смайлик: супер Смайлик: умник Смайлик: чайник Смайлик: сходка Смайлик: Ура! Смайлик: не получается!
Перевод выделенного текста из латиницы в кирилицу. Текст в квадратных скобках '[]' не преобразуется

Пример: biologija -> биология [b] - полужирный шрифт

Пример: [b]полужирный[/b] [i] - курсив

Пример: [i]курсив[/i] [u] - подчёркнутый

Пример: [u]подчёркнутый[/u] [sup] - верхний индекс

Пример: температура 37[sup]o[/sup]C [sub] - нижний индекс

Пример: H[sub]2[/sub]O - вода [QUOTE] - применяется для цитирования чужих сообщений, цитата вставляется с небольшим отступом от края текста

Пример: [QUOTE]цитата[/QUOTE] [code] - форматирование как при вводе
Применяется для вывода теста как он есть, с предотвращением форматирования (автопереноса на новую строку), без интерпретации кодов форума и смайликов; вставляется с небольшим отступом от края текста.

Пример: 
[code]
программный код
	1 строка
	2 строка
[/code] [list] - список:
возможны опции: 1, a, A, i, I
[list] неупорядоченный; 
[list=1] нумерованный; 
[list=A] упорядоченный по буквам A-Z

Пример:
[list=1]
[*] первая строка;
[*] вторая строка;
[/list] Тег [hr] - горизонтальная разделительная линия

Пример: 
Абзац 1
[hr]
Абзац 2 [url] - гиперссылка

Примеры:
[url]www.ncbi.nlm.nih.gov[/url]
[url=http://www.ncbi.nlm.nih.gov/]NCBI[/url] [email] - ссылка на адрес электронной почты

Пример: [email]masha@mail.ru[/email] Тег [img] - рисунок
[img] - в строке;
[imgL] - выравнивание по левому краю; 
[imgR] - выравнивание по правому краю.

Пример:
[img]http://molbiol.ru/izo/rl.gif[/img] [ru] - только для русских читателей

Пример:
[ru]это увидят только те, кто использует русский интерфейс[/ru] [en] - только для английских читателей

Пример:
[en]это увидят только те, кто использует английский интерфейс[/en] [self] - текст виден только вам и администрации

Пример:
[self]это увидите только вы сами[/self]
[left] - выравнивание по левому краю

Пример: [left]текст слева[/left] [center] - выравнивание по центру

Пример: [center]текст в центре[/center] [right] - выравнивание по правому краю

Пример: [right]текст справа[/right] [just] - выравнивание по обоим краям

Пример: [just]выровненный текст[/just]

     размер сообщения / макс. размер:  / 15360


Последние 10 сообщений [ в обратном порядке ]
KCN Отправлен 11.12.2018 10:36
  Да, для тех кто сомневается в том, что HPLC пригодна для работы с белками, причем не только для аналитики но и минипрепаратива и даже препаратива:

1. The Handbook of Analysis and Purification of Peptides and Proteins by Reversed-Phase HPLC, the Grace Vydac Technical Support Group.
2. The Handbook of Analysis and Purification of Peptides and Proteins by Reversed-Phase HPLC Presented by Vydac (The Separations Group).
3. HPLC of Peptides and Proteins: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) Hardcover – December 15, 2003 by Marie-Isabel Aguilar
4. Руководства к колонкам Zorbax 300SB-C18, SB-C18, SB-300 C8, 300 SCX, ODS C18, Zorbax phenyl , GF-450, GF -250, Eclipse XDB-C18, TSK SP-5PW , TSK G3000SW, TSK CM-3SW, 4.6/9.4 mm и толще, толще... wink.gif
guest: great Отправлен 31.10.2018 16:27
  Superbly written article, if only all bloggers offered the same content as you, the internet would be a far better place.
http://www.techallabout.com
KCN Отправлен 24.10.2018 11:50
  Вот, собственно, ссылки по валидации очистки рекомбинантного белка от ДНК клеток хозяина.
Надеюсь, будут полезны тем, кто идет по этому тернистому пути.
Методики: qPCR в большинстве случаев, реже гибридизация с Р32 меченой ДНК, спектрофотометрия, преципитация ДНК белками.

USP
http://www.pharmacopeia.cn/v29240/usp29nf2...45_viewall.html
https://pdfs.semanticscholar.org/f62f/12df1...fcc40ce310a.pdf
https://www.liebertpub.com/doi/abs/10.1089/...journalCode=gen
http://www.pharmacopeia.cn/v29240/usp29nf2...45_viewall.html

USP 29, 1045, biotechnology-derived articles

EP
1.9.2.25 Residual Host Cell DNA (Characterization)

ICH
ICH Q6B Specifications , p 473, 2017.

FDA
http://www.analisa-scientific.com/march-2014-enewsletterar/
http://www.who.int/biologicals/Molecular%2...20April2005.pdf

NCBI
https://www.google.com/url?sa=t&rct=j&q=&es...wABLPwzKd1SrmEZ
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3235147/
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28426392
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24042121

RG
https://www.researchgate.net/publication/25...utical_products

Коммерческие решения и патенты
https://pdfs.semanticscholar.org/f62f/12df1...fcc40ce310a.pdf
https://patents.google.com/patent/WO2012028740A1/ar

WHO
http://www.who.int/biologicals/biotherapeu...19_Nov_2013.pdf
KCN Отправлен 11.10.2018 15:36
  Выбрал две минипрепаративные колонки с С18, хочу попробовать еще и на них. Если куплю их и что получится - отпишусь.

Choose:
80Å for < 4 - 5 kD
300Å for > 4 - 5 kD

1. Protein Separations
Reversed-Phase Columns C18
StableBond (80Å) Reversed-Phase HPLC Columns
ZORBAX StableBond Columns (80Å) Ordering Information
Semi-Preparative
9.4x250 mm,5 mkm,
880975-202

2.Protein Separations
Reversed-Phase Columns C18
ZORBAX StableBond (300Å) Column Ordering Information
Semipreparative
9.4x250 mm, 5 mkm,
880995-202

http://www.proquinorte.com/es/productos/cr...scargas/bio.pdf

Притом для пептидов и белков производители рекомендуют С18, фенилку считают менее подходящим вариантом. И система буфер1/буфер2+ацетонитрил %, с вариациями с ТФУ. А не 2М (NH4)2SO4/ddH2O и фенилка.
KCN Отправлен 11.10.2018 14:41
  Что касается работы с белками, с молекулярными массами 1- 50 кДа и более, не только с пептидами, привожу ссылки на документы производителя Agilent 1100 , колонки Zorbax:

https://www.agilent.com/cs/library/brochure...-2103EN_150.pdf
http://www.proquinorte.com/es/productos/cr...scargas/bio.pdf
http://quimica.udea.edu.co/~carlopez/hplc/...log-2011-12.pdf

Хорошие колонки для работы: 9.4 мм и 21.2 мм в диаметре - это минипрепаративные и препаративные колнки, позволяют очистить от 15 до 50 мг материи. НО: на прибор Agilent 1100 производитель НЕ рекомендует ставить колонки "толще" 9.4 мм, т.е. только минипрепаративные.
Ну, мне достаточно. Притом для пептидов и белков рекомендуют С18, фенилку считают менее подходящим вариантом.

P.S.:
Протокол чистки трипсином, может кому понадобится: 180 минут со скоростью подачи трисового буфера рН 7.4 0.15 мл/мин, инъекция трипсина ( до 1 мкг/мл), 100 мкл, температура 36С, колонка 4.7x250 мм.
Чиститься отлично, после трипсина можно промыть градиентом буфер/30% изопропанол, со скоростью 0.3 мл/мин, так как изопропанол очень вязкий, вымывает остатки трипсина и пептиды.
KCN Отправлен 08.08.2018 11:47
  FPLC чаще используется для белков, HPLC - для низкомолекулярных веществ. Но когда мне надо проанализировать пептиды или белки я так же использую HPLC. Например фибринопептиды А и В , методика по Henshen. Или к примеру b-beta-N-domen, alpha-C-region фибриногена. Это уже домены 14-12 кДа. Более того, белки можно выделить и отнести на масспектр. Для zorbax du pont instruments колонки с фенильной прививкой , оказалось возможным получать микрограммы очень чистых белков и пептидов из плазмы крови или из фибриногена после черновой очистки центрипрепом, FPLC , осаждением фибрина/фибриногена температурой 54-58C. Эти фракции можно не только анализировать на масспектре, но и колоть мышками для иммунизации. Так же неплохо почистился вышеуказанный рекомбинантный белок (54 кДа). Если важна чистота пептида или белка о примесей, отличающихся на пару аминокислот и дающих перекрестную реакцию на моноклонах - HPLC годный вариант, лучше чем FPLC. И если у вас этого белка очень мало - порядка микрограмм. В остальных случаях я использую FPLC.

Если колонка забивается белком, например остатками фибриногена, я обычно прокачиваю трипсином в соответствующем буфере, и оставляю в нем систему на ночь. Утром промывают и все работает. Больше всего мне нравится возможность различать белок на C18-C8-фенилке и других колонках этого типа при разнице в одну аминокислоту, даже незаряженную.
И связка HPLC-масспектр себя хорошо зарекомендовала. Для рекомбинантных пептидов и белков есть смысл ставить предколонку. Набивают ее при помощи FPLC packing chamber, если набить вручную высокое давление спрессует сорбент и будет пузырь с буфером. Пакующая камера позволяет не пускать сорбент в буфере через насос FPLC, а выдавливать его в колонку или предколонку как из шприца. Есть специальные аппараты для паковки колонок и предколонок, но они дороже чем пакующая камера и узкоспециализированны. В них нет особого смысла. Если предколонку забьет ДНК, ее можно отсоединить от колонки и промыть буфером с ДНКазой, оставив так же на ночь. Это я пока не пробовал.
Добрыня Никитич Отправлен 05.08.2018 10:25
 
(KCN @ 09.07.2018 20:22)
Ссылка на исходное сообщение  Добрый день всем!
Стоит задаяа - очистить рекомбинантный белок с His-tag от урезанных форм и агрегатов на силикогельевой колонке для HPLC с фенильной прививкой в градиенте 2M (NH3)2SO4, подкисленный 0.1% трифторуксусной кислотой / бидистилированная H2O .  Белок и его урезанные формы и агрегаты предварительно получены солюбилизацией телец включения и очисткой на Ni-NTA агарозе (элюция имидазолом). Эксклюзивную хроматографию использовать нельзя, так как образца очень мало - он используется под иммунизацию мышей для гибридом. Образец находится в буфере с сахарозой (выпадает в осадок без сахарозы или глицерина при замораживании). Очищать получается, но в системе присутствует ДНК. ДНК фрагментировали ультразвуком, затем обрабатывали ДНК-азой. Но что-то осталось. Фенилка имеет слабый положительный заряд, снять ДНК с нее получалось в солевом буфере, блокирующем отрицательный заряд фосфатов, с градиентом. Колонка не убилась так как использовал предколонку. По спектру на 254 нм было ясно видно что идет ДНК. (Прибор Agilent 1100).
Что лучше делать:
1. Обработать ультразвуком, затем ДНКазой.
2. Осадить полиэтиленимином
3. Осадить + заряженным хроматографическим сорбентом (Q-сефароза, DEAE)
Пробовал методы 1 и 3. ДНКаза работет не полностью, возможно надо диализировать в буфер, в котором она работет лучше. Один ультразвук не вариант - он только фрагментирует ДНК, а не удаляет.  при выполнении метода 3 белок связывется с сорбентом сильнее чем ДНК. Методом 2 не решил воспользоваться так как остаток полиэтиленимина может намертво сесть на фенилку.
4. Может как-то использовать центрипреп?
Как валидировать очистку?
Пробовал при помощи спектрофотометра как 254 нм так и сканировать спектр 200 - 300 нм. Но что-то выглядит неубедительно. Кстати, взаимодействуя с белком ДНК меняет спектр поглощения. Но это не главное.
Буду благодарен за любую помощь.

Блин, ну HPLC используется для очистки низкомолекулярных веществ,
а для очистки белков используется FPLC
Вы точно понимаете что вы делаете?
KCN Отправлен 27.07.2018 09:07
  Удалил ДНК при помощи ультразвука и обработки ДНК-азой EN 0521 DNA-se I Fermentas. Отправил пробы до УЗ, после УЗ, до DNA-зы и после DNA-зы на qPCR с сиквенс праймерами. После обработки DNA-se согласно методикам производителя, ДНК в пробе обнаружено не было. Благодарю за внимание, всем удачного дня!
KCN Отправлен 21.07.2018 17:33
  Возможно ошибка в том, что белок после отгонки органики надо расстворять не в PBS а в 8М мочевине или гуанидине + бетамеркаптоетанол для восстановления дисульфидных связей. Как тельца включения. А потом переводить в PBS или другой буфер путем диализа с добавлением перекиси водорода для окисления дисульфидных связей (что-то типа ренатурации диализом, низкая концентрация белка будет мешать образованию межмолекулярных агрегатов).
KCN Отправлен 20.07.2018 14:25
  Приехал. Решил опробовать фенольный метод. Вначале я решил выяснить, можно ли так работать с белком вообще без ДНК.
Для того чтобы не тратить рекомбинантный белок, потренировался на лизоциме из куринного яйца и на человеческом сывороточном альбумине.
Оба белка расстворил в буфере PBS pH 7.4, добавил фенольную фазу, размешал на vortex.
Собрал фенольную фазу, добавил гексан и петролейный эфир. Произвел отгонку.
Белок сформировал хлопьеорбразный осадок после отгонки органики.
Повторное расстворение в PBS произошло не полностью - белок плавал агрегатами,
хлопьями, появилась муть. Колоть такое в хроматограф - убить колонку.
В лучшем случае очитститься трипсином на ночь с последующим градиентом ddH2O / acetonitrile.
Такое поведение белка связано с тем, что формеруемый гидрофобными остатками кор белка разворачивается в огранических расстворителях и полностью денатурирует. При отгонке и переводе в водную фазу коровые гидрофобные аминоксилоты разных полипептидных цепей принадлежащих разным молекулам взаимодействуют между собой, вытесняя воду и образуют
межмолекулярные агрегаты, непригодные для хроматографирования и иммунизации животных.
Поэтому вопрос об анализе полноты удаления ДНК из такой системы отпал сам собой. Будем использовать УЗ и ДНК-азу.
Посмотреть тему (откроется в новом окне)

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 22.01.20 14:45
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft