Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Неспецифические взаимодействия белков с анионобменниками -- Бывают ли? --
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! metrim
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 16.01.2018 01:48     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование
Вопрос
Собственно понадобилось поработать с белком из цианобактерий, зелененьким, так что его по крайней мере хорошо видно.
И вот странность: при рН 7 он не задерживаясь проскакивает через DEAE-Toyopearl , равно как и при рН 7,5, 8, 8,5, 9. Вообще не задерживается.
Решил я попробовать DEAE-sephadex и на нем картина вообще обратная и дикая: при перечисленных рН зелень на колонке садится и потом независимо от рН и ионнной силы не желает смываться с колонки. Как такое может быть ??
Участник оффлайн! sceptique
Постоянный участник
временной жизни



 прочитанное сообщение 16.01.2018 02:14     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

Какой марки Тойопёрл? DEAE-650?

Сообщение было отредактировано sceptique - 16.01.2018 02:15
Участник оффлайн! sceptique
Постоянный участник
временной жизни



 прочитанное сообщение 16.01.2018 02:17     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

Вы смывать 2М NaCl в 7М гуанидине пробовали то что залипло?

Попробуйте весь ряд колонок, от (слабо- и сильно-) катионо- до (слабо- и сильно-)анионообменных при нативных pH, никогда нельзя предугадать что лучше чистит. Все программы моделирования какой нужен ионнообменный матрикс - тупо не работают, которые теоретически-вычислительные, на них даже время не тратят обычно.
Тупо пробуйте весь диапазон матриксов что есть - и тупо выберете тот, который липнет и слезает хорошо.

Может, просто белок гидрофобный попался и липнет к матрице а не к заряженным головкам.

На подумать: этот белок может быть огромадным белковым комплексом, кторый больше размеров пор. А глазу это заметно не будет - стоит это засунуть в гуанидин то выделятся лишь мономеры Вашего белка. А в нативных условиях будут целые сбившиеся олигомеризованные поля... rolleyes.gif

Сообщение было отредактировано sceptique - 16.01.2018 02:25

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): metrim
Участник оффлайн! metrim
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 16.01.2018 02:47     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

(sceptique @ 16.01.2018 03:14)
Ссылка на исходное сообщение  Какой марки Тойопёрл? DEAE-650?
DEAE-650M , а бывают какие то еще ?
Участник оффлайн! metrim
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 16.01.2018 03:03     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

(sceptique @ 16.01.2018 03:17)
Ссылка на исходное сообщение  Вы смывать 2М NaCl в 7М гуанидине пробовали то что залипло?
До таких изысков не дошел, попробовал только разными рН от 4,5 до 9 ну и до 1М соли. Полагал, что это должно то отодрать ...

Попробуйте весь ряд колонок, от (слабо- и сильно-) катионо- до (слабо- и сильно-)анионообменных при нативных pH, никогда нельзя предугадать что лучше чистит. Все программы моделирования какой нужен ионнообменный матрикс - тупо не работают, которые теоретически-вычислительные, на них даже время не тратят обычно.
Тупо пробуйте весь диапазон матриксов что есть - и тупо выберете тот, который липнет и слезает хорошо.
Ну у меня не особо богатый выбор: тойоперл, да сефадексы, сефароз и т.д. - нет. Ну есть еще понятно целлюлоза, но затеваться с ней как то не особо смысла та ....

Собственно экзерсисы у меня происходили в следующем порядке: вначачале белок проскочил через ДЕАЕ-тойоперл. Было предположение, что белок где-то 40-80кДа (из литературы), потому я взял в бой QAE-Sephadex A-50 , наносил на него без соли, пробовал смывать ступенчато солью, потом стал перебирать уже все подряд варианты. Зона из начала колонки никуды не двигалась, фаза понятно сжималась.
Я решил, что возможно белок "залип в порах", потому сегодня приготовил DEAE-sephadex A-25 , но с ним ситуация та же , только размыв зоны получается значительней, что как бы логично, коли белок в диапазоне 40-80кДа. В этот прогон я наносил ууравновешенное 100мМ NaCl

Может, просто белок гидрофобный попался и липнет к матрице а не к заряженным головкам.
Ну как бы по идее то (на сколько я представляю) это наоборот: гидрофобный бы бодрее за тойопёрл цеплялся, сефадекс то погидрофильней будет. + я для пробы нанес пробу на же-10, там ни малейших задержек и сорбции.
ТАк что коли б гидрофоность, то было б паде на октилсефарозе из бессолевого буфера несложно зацепить?
Еще наблюдение: я концентрировал и переводил на буфер образец в центриконах, так там зелень концентрировалась внизу конуса. может ли это свидетельствовать о гидрофобности и иных свойствах ?
Участник оффлайн! ksm
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 16.01.2018 07:18     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

мембранный белок, поди, раз зеленый? тритоном...
Участник оффлайн! metrim
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 16.01.2018 11:56     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

Ну меня уверяли, что мембраны тщательно посадили фугованием, сульфатом и т.д. и этот белок из растворимой фракции...
А сколько тритона полагаете разумным заправить, дабы белок таке не развалился ?
Участник оффлайн! ksm
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 16.01.2018 12:05     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

если белок из растворимой, то вряд ли он будет зеленым. очевидно, что клетки "перерушили", скорее всего прессом Френча - при этом там ошметки тилакоидов начинают вести себя не как мебраны, а как зеленая хрень и с трудом уходят в осадок даже в ультре. Можно попробовать вылечить добавив к зеленому раствору сульфата и попробовать переосадить. в вашем случае, наверное, проще игнорировать зеленую хрень, а потом просто лечить колонку. когда я с подобным столкнулся, мне нужно было чистить аффинной хроматографией белок, зеленая хрень испоганила колонку, которую я потом мыл раствором тритона, который ливанул "на глаз". насколько помню, колонку удалось отмыть.
Участник оффлайн! vb
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 16.01.2018 13:18     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

А зеленый не за счет ионов металлов каких? А то может ионообменник их хелатирует намертво. Бывает такое.
Участник оффлайн! metrim
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 16.01.2018 13:19     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

Ну в данном случае "колонки" меня не сильно волнуют smile.gif Я просто набил по неско мл в картриджи для твердофазной экстракции, что бы посмотреть что как себя ведет, так что эти подопытные - просто в помойку отправятся без сожалений. Я надеялся отработать условия для концентрирования и очистки "зеленой хрени".

Вот было дело мне акурат подобная "зеленая хрень" забила никелевую колонку, при том полностью заблокировав связывание меченного гистидином белка, вот тогда я да, намучался с отмывкой то колонки ......

Кстати, а вот у меня лежат фармациевские запечатанные (древние понятно) упаковки аффинных сорбентов, может быть удастся с кем то сменяться на Q-Sepharose ,ну или какие то современные общеупотребимые сорбенты? Не думаю, что мне когда нибудь понадобится антителами то заниматься....
Участник оффлайн! metrim
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 16.01.2018 13:35     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

(vb @ 16.01.2018 14:18)
Ссылка на исходное сообщение  А зеленый не за счет ионов металлов каких? А то может ионообменник их хелатирует намертво. Бывает такое.
Ну предположительно что это "водорастворимый хлорофил-белковый комплекс". Метал там понятное дело есть, но расположен как бы не на поверхности. + как анионобменник будет хелатировать катион? ну и если бы такие взаимодействия шли с ДЕАЕ, то они бы и на варианте тайпрловой матрицы происходили
Участник оффлайн! Tom1
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 16.01.2018 16:35     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

то что скорее всего там есть мембраны и другая жирнота как раз говорит поведение на Тойетаперле...
У данного сорбента очень высокая остаточная гиброфобность...
и места белкам просто не хватило...
НМе понятно о каких порах идет речь в случае ионнообменноий хроматографии????
то что "зелень" была в нозу конуса обючное явление не только для данного белка, а для всех белков...
Зелень скорее всего что-то побоное леггемоглобину т.е. белок с гемом и металлов....
то что он забил никеливую колонку не удивительно тоже самое будет если на нее нагрузить подлизированную кровь весь гемоглобин будет сидеть, а колонке все остальное в проскоке...
Что бы я посоветовал....
есктрагировать в высокой соли до 1 М и пропустить через P11 фосфоцеллюлозу, хорошо помогает в случае таких "жирных" и грязных екстрактов....
а уж потом соответствен но разбавив сажать на ДЕ к примеру....

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): metrim
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 16.01.2018 16:48     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

Зелёный белок синезелёных водорослей липнет к мембранам и обычно осаждается с клеточным дебризом. В раствор он переходит при добавлении 5...10% этанола. Так что советую промыть колонку слабыми спиртовыми растворами. Хотя синезелёных водорослей очень много,и белки у них могут отличаться. Я экспериментировал со сфероностоком.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): metrim
Участник оффлайн! metrim
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 17.01.2018 11:24     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #14 множественное цитирование

(Tom1 @ 16.01.2018 17:35)
Ссылка на исходное сообщение  то что скорее всего там  есть мембраны и другая жирнота как раз говорит поведение на Тойетаперле...
У данного сорбента очень высокая остаточная гиброфобность...
Мне казалось, что гидрофобный белок должен был бы наоборот залипнуть на гидрофобной матрице тойоперла, а не проскакивать через него влет. Т.е. на нем бы как раз параллельно шла и ионобменная и "млость гидрофобная" хроматография в случае гидрофобного белка. Я знаю, что были как раз случаи, что всякие меланины и т.д. на эксклюзионном тайоперле намертво залипали и промывались разве 1М щелочью.

НМе понятно о каких порах идет речь в случае  ионнообменноий хроматографии????
Ну в случае сефадексов, маттрица на основе G-25 и G-50 со всеми вытекающими.
Это в случае тайоперла и сефарозы - поры бесконечно и пренебрежимо огромные, а в случае например моно-ку - пор попросту нет и все процессы идут сугубо по заряженным группам.

Что бы я посоветовал....
есктрагировать в высокой соли до 1 М  и пропустить через P11 фосфоцеллюлозу, хорошо помогает в случае таких "жирных" и грязных екстрактов....
а уж потом соответствен но разбавив сажать на ДЕ к примеру....
Я прогнал белок на ВЭЖХ на TSK2000 , получилось что то вроде 50кДа. Попробую сделать форез не грея пробу, может быть увижу зеленую полоску, прикину массу, а так же - посмотрю что еще в пробе то болтается. Удивительно, но по ВЭЖХ не сказать, что в образце как то масса других белков, получился большой пик с зеленой составляющей спектра, мусор в нулевом объеме (в том числе вероятно и с агрегатами зеленого) ну и по мелочи несколько белков поменьше
Участник оффлайн! Tom1
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 17.01.2018 17:01     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #15 множественное цитирование

Мне казалось, что гидрофобный белок должен был бы наоборот залипнуть на гидрофобной матрице тойоперла, а не проскакивать через него влет.
========================================
если в образце полно всякой жирной дряни типа липидов, обломков мембран и т.д. они налинут, а белки с их "хилой" относительно их гидрофобностью будут в "пролете" в обеих смыслах...

Всего благодарностей: 2Поблагодарили (2): metrim, sceptique
Участник оффлайн! Tom1
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 17.01.2018 17:03     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #16 множественное цитирование

Удивительно, но по ВЭЖХ не сказать, что в образце как то масса других белков, получился большой пик с зеленой составляющей спектра, мусор в нулевом объеме (в том числе вероятно и с агрегатами зеленого) ну и по мелочи несколько белков поменьше
======================================================
или одно из двух ...
"зеленый" деийствительно мажорно выделяется в данных условиях.
Его в самом деле много и от просто мажется по колонке и путает всю картинну, образуя микро агрегаты и тому подобное...

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): metrim
Участник оффлайн! metrim
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 18.01.2018 02:23     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #17 множественное цитирование

(Tom1 @ 17.01.2018 18:03)
Ссылка на исходное сообщение  
или одно из двух ...
"зеленый" деийствительно мажорно выделяется в данных условиях.
Его в самом деле много и от просто мажется по колонке и путает всю картинну, образуя микро агрегаты и тому подобное...
Ну я перед заколом на ВЭЖХ погонял на 10кДа центриконе, перевел на элюэнт, так что от низкомолекулярки худо-бедно таки избавился....
Сопоставил с калибровкой ВЭЖХ, основной пик на 22-24кДа пришелся.
Поставил форез 12,5%, жирная полоса получилась где то на 19-20кДа, надо будет 15 или 20% сделать, что бы поточнее растянулось.
При этом сделал я вариант с и без прогревом на 95 градусах. В обоих вариантах зеленое пятно сразу выскочило перед бромфеноловым и двигалось дальше на одном и том же расстоянии. В кипяченом полоса на 19кДа жирная, на порядок интенсивнее нескольких других полосок, находящихся в диапазоне 100+кДа (то что как раз в нулевом объеме на ВЭЖХ вылетело) и во фронте.
В обоих вариантах желто-зеленая дрянь осталась обильно в лунках.
В некипяченом варианте была сразу после фореза слабая зелененькая полосочка, но она даже не вошла в разделяющий гель, вероятно что то очень здоровенное. После переноса на мембрану и проявки в некипяченом варианте никаких полосок, кроме слабой во фронте - не наблюдалось. Вот такие пироги ....
Участник оффлайн! metrim
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 20.01.2018 18:51     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #18 множественное цитирование

ЗЫ По размышлениям у меня появилась еще версия: что именно наблюдалоси на сефадексах: Похоже зеленый пигмент имеет очень приличный отрицательный заряд и его просто "вырывает" из комплекса белкового и прибивает к анионобменным группировкам. Так что "зелень на колонке" я вижу не белок , а пигмент наглухо сорбированный. Колоночки я кажется еще не выкинул, если руки дойдут попробую вытеснить зелень более ядреным анионом.
Участник оффлайн! ksm
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 20.01.2018 21:05     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #19 множественное цитирование

дане, хлорофилл от белка оторвать - ацетонить надо))
Участник оффлайн! metrim
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 20.01.2018 23:18     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #20 множественное цитирование

(ksm @ 20.01.2018 22:05)
Ссылка на исходное сообщение  дане, хлорофилл от белка оторвать - ацетонить надо))
Ну если коли то в форезе он разом "отлетает"...
К тому же вроде хлорофил ниже 10 вообще не заряжен, так что у меня может и не хлорофил вовсе или "не вполне обычный хлорофил", хотя по спектру - вполне даже ......
Участник оффлайн! watchesbiz
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  20.11.2021 18:16     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #21 множественное цитирование

http://www.authorstream.com/Replicawatches24/
https://about.me/Replicawatches24
https://moz.com/community/users/17050093
https://trello.com/rolexrelicawatches/activity
https://replicarolexwatches.dreamwidth.org/365.html
https://visual.ly/users/watcheshutuk/portfolio
https://www.viki.com/users/watcheshutuk_549/about
https://www.academia.edu/s/14bdb7d4fe?source=link
https://www.slideshare.net/Nowseore/guide-o...ex-watch-online
https://audiomack.com/rolexrelicawatches
https://soundcloud.com/replicarolexwatches
https://www.bagtheweb.com/u/fakerolexwatches/profile
https://www.flipsnack.com/ReplicawatchesUK/...ca-watches.html
https://www.4shared.com/office/zA4L7Rmzea/G...hase_a_Fak.html?
https://codepen.io/Rolexrelicawatches/full/abBEzaQ
Участник оффлайн! watchesonline89
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  26.12.2022 11:24     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #22 множественное цитирование

https://telegra.ph/Advantages-Of-Replica-Watches-08-03
https://issuu.com/home/published/_6_.docx
https://www.gta5-mods.com/paintjobs/watchesswiss
https://omegawatches89.onweb.it/
https://padlet.com/omegawatches89/je3eq9ol3xzmb9bp
https://www.pinterest.com/omegawatches89/
https://knowyourmeme.com/users/omegawatches89
https://bitcointalk.org/index.php?topic=76487.new#new
https://omegawatches89.blog.hu/
https://knowyourmeme.com/forums/general/top...f-so-why?page=1
https://penzu.com/p/c6f21f5d
https://www.reddit.com/user/omegawatches89/...are_so_popular/
https://www.vingle.net/posts/4647076
https://penzu.com/p/c68b65cc
https://diigo.com/0pige9

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 30.03.24 02:50
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft