Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Много геномки на геле
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! jelenarus




 прочитанное сообщение 21.06.2018 18:58     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Здравствуйте)
Очень много геномной ДНК на геле 1%, при чем, что ставлю ПЦР я на плазмиду (выделяла ее из ночной культуры набором для выделения плазмид от евроген)
в чем может быть проблема и как избежать этого?

Картинки:
картинка: qjsxNE7QVj0.jpg
qjsxNE7QVj0.jpg — (107.32к)   

Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 21.06.2018 21:52     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

Так это после ПЦР?!!! confused.gif
Или после выделения?

После нейтрализующего раствора творожистый осадок был?
Участник оффлайн! jelenarus




 прочитанное сообщение 21.06.2018 22:19     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

(MMM @ 21.06.2018 22:52)
Ссылка на исходное сообщение  Так это после ПЦР?!!! confused.gif
Или после выделения?

После нейтрализующего раствора творожистый осадок был?

Это уже после ПЦР frown.gif
Да, был
Участник оффлайн! X34
Участник



 прочитанное сообщение 22.06.2018 01:20     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

похоже на аццкий перегруз по матрице, разведите материал в 10-100-1000 раз и переставьте ПЦР с разведенок. а еврогеновские наборы таки да, то еще гэ...
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 22.06.2018 02:29     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

(jelenarus @ 21.06.2018 23:19)
Ссылка на исходное сообщение  Это уже после ПЦР frown.gif
Да, был


Концентрацию ДНК после выделения плазмиды измеряли? Форез выделенной плазмиды делали? Зачем вообще выделяли плазмиду, а не делали ПЦР просто с колонии после лизиса кипячением.
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 22.06.2018 09:10     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

На форезе явно видна плазмида - мономерные и димерные суперспирали, немного линейной, но в основном никованные формы. Это значит, что матрицей в ПЦР служил очищенный концентрированный препарат плазмидной ДНК. В этом случае вместо целевого фрагмента образуются тандемные полимеры плазмидной ДНК различной длины, часто содержащие длинные однонитевые хвосты. А гибридизация этих хвостов ещё сильнее увеличивает полимерность синтезируемых фрагментов. Так что картинка вполне характерная. Другой и быть не могло.

Попробуйте поставить ПЦР с той же матрицей (плазмидой), но разведённой в 1000, 10000 и 100000 раз. Если в плазмиду встроился искомый ген или фрагмент ДНК (и если праймеры не кривые), то ампликон на форезе проявится.
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 22.06.2018 10:42     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

ПЦР пройдет и без выделения, на лизатах если в меру конечно...
Две причины, даже три:
1. переизбыток матрицы. Генсек предлагает разбавить в 100 000 раз, а я - еще больше! Если концентрация плазмиды (чего проще указать сколько матрицы внесли в реакцию confused.gif ) 100 нг/мкл, можете разбавлять её в 100 000 000 раз и делать 33-35 циклов...
2. горбатые праймеры или сложная вторич. структура ампликона (с повторами, шпильками с 5- штрих выступающими концами и т.п.)...
3. не известно от чего. У меня тоже бывает такое с идеальными праймерами, с той же оптимизированной системой и лучшими полимеразами и на тебе шмеры регулярные. В этом случае я переделываю праймеры и все. Танцевать с бубнами нам некогда - жизнь так прекрасна, но так коротка! smile.gif
Участник оффлайн! R-J-Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 22.06.2018 11:19     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

Выделять плазмиду можно любым способом, хоть китом (разумеется, любым, результат будет разниться только в кол-ве выделенной ДНК, и все), хоть вручную, хоть вообще не выделять, а кинуть в ПЦР 1 мкл ночнушки. ПЦР с 5 нг плазмиды придет за 20 циклов, с ночнушки- за 25, чем сильнее разведете плазмиду, тем чище будет ПЦР-продукт (до известного предела, конечно), но это если праймеры нормальные- не в данном случае, я вижу "бомбу", это напрягает

Сообщение было отредактировано yack - 22.06.2018 17:32
Участник оффлайн! Carbon Copy
Постоянный участник
So close no matter how far



 прочитанное сообщение 22.06.2018 16:45     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

jelenarus - Разведите преп в 10000 раз, как уже тут советовали, и будет Вам щасье.
genseq - Хорош ужасы рассказывать про однонитевые хвосты. В большинстве случаев высокая концентрация ДНК просто ингибирует ПЦР и всё.
guest: petr
IP-штамп: frESYufl5slOA
гость



 прочитанное сообщение 27.06.2018 16:36     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

Мне кажется там и праймеры хорошо бы развести. Там какой-то ацкий перегруз не только по матрице, но и по праймерам. jelenarus, сколько праймеров вы кладете в ПЦР?
Участник оффлайн! jelenarus




 прочитанное сообщение 27.06.2018 18:06     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

(guest: petr @ 27.06.2018 17:36)
Ссылка на исходное сообщение  Мне кажется там и праймеры хорошо бы развести. Там какой-то ацкий перегруз не только по матрице, но и по праймерам.  jelenarus, сколько праймеров вы кладете в ПЦР?

2,5 мкл на 50 мкл смеси, финальная концентрация 0,5 мкМ
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 27.06.2018 18:07     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

Все таки интересно было бы взглянуть на форез плазмиды до ПЦР.
Участник оффлайн! jelenarus




 прочитанное сообщение 27.06.2018 18:29     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

(MMM @ 27.06.2018 19:07)
Ссылка на исходное сообщение  Все таки интересно было бы взглянуть на форез плазмиды до ПЦР.

Никогда не ставила форах плазмиды чистой. Как ее кидать, просто, без разведений или как? Сколько мкл?
Участник оффлайн! jelenarus




 прочитанное сообщение 27.06.2018 18:32     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #14 множественное цитирование

Я поставила ПЦР с разведением, геномка действительно ушла, но и сам нужный Бенд стал тусклее + яркая Шмера осталась
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 27.06.2018 20:28     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #15 множественное цитирование

(jelenarus @ 27.06.2018 19:29)
Ссылка на исходное сообщение  Никогда не ставила форах плазмиды чистой.

Это настораживает! Ну нанограмм 100-500 на дорожку достаточно под BrEt.
guest: petr
IP-штамп: frESYufl5slOA
гость



 прочитанное сообщение 27.06.2018 21:41     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #16 множественное цитирование

(jelenarus @ 27.06.2018 18:06)
Ссылка на исходное сообщение  2,5 мкл на 50 мкл смеси, финальная концентрация 0,5 мкМ

Хм... странно, вроде нормальная концентрация. МОжет праймеры димеризуются. Сиквенсы праймерров в студию pls.
Участник оффлайн! R-J-Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 28.06.2018 00:26     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #17 множественное цитирование

(jelenarus @ 27.06.2018 19:29)
Ссылка на исходное сообщение  Никогда не ставила форах плазмиды чистой. Как ее кидать, просто, без разведений или как? Сколько мкл?

вау!!! конец цитаты
Участник оффлайн! jelenarus




 прочитанное сообщение 28.06.2018 18:59     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #18 множественное цитирование

(R-J-Dio @ 28.06.2018 01:26)
Ссылка на исходное сообщение  вау!!! конец цитаты

вы так нетерпимы...
Участник оффлайн! R-J-Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 29.06.2018 01:19     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #19 множественное цитирование

это еще что... сейчас я само благодушие...жарко
Участник оффлайн! NMR-guy
Постоянный участник
временной жизни



 прочитанное сообщение 29.06.2018 11:21     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #20 множественное цитирование

Пусть барышня учится у себя искать ошибки. А ошибка, судя по параллельной теме, у неё в отсутствии знакомства с элементарными утилитами проверки генетического кода [инсерта] на количество сайтов рестрикции. Буду рад ошибиться.
Участник оффлайн! R-J-Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 29.06.2018 12:43     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #21 множественное цитирование

думаю, все несколько более запущено
Участник оффлайн! jelenarus




 прочитанное сообщение 29.06.2018 14:45     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #22 множественное цитирование

(guest: petr @ 27.06.2018 22:41)
Ссылка на исходное сообщение  Хм... странно, вроде нормальная концентрация. МОжет праймеры димеризуются. Сиквенсы праймерров в студию pls.

F 5'-3' ggacggacatCTAGACATTGAAGTCCTGATTTATC
R 5'-3' gtgtgattgaCTTCTGAGGCGGAAAGAAC
Участник оффлайн! R-J-Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 29.06.2018 14:55     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #23 множественное цитирование

нормальные олиги
guest: petr
IP-штамп: frESYufl5slOA
гость



 прочитанное сообщение 29.06.2018 16:55     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #24 множественное цитирование

(jelenarus @ 29.06.2018 14:45)
Ссылка на исходное сообщение  F 5'-3' ggacggacatCTAGACATTGAAGTCCTGATTTATC
R 5'-3' gtgtgattgaCTTCTGAGGCGGAAAGAAC

Хм... Да, вполне себе нормальные. Тогда хорошо бы, как уже и говорили, после выделения на саму плазмиду в геле посмотреть.
Участник оффлайн! watchesbiz
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  20.11.2021 17:43     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #25 множественное цитирование

https://jumpshare.com/v/QxZ9Rn2mfDCaBq2AdBG1
https://www.edocr.com/v/znnrba3z/watcheshut...lica-Watches-UK
https://www.tuugo.us/Companies/best-replica...s/0310006695505
https://topsitenet.com/article/988178-hints...ca-rolex-watch/
http://simp.ly/p/nxGlWb
https://telegra.ph/Hints-on-Choice-of-a-Hig...lex-Watch-02-22
https://replicarolexwatche2.blog.fc2.com/blog-entry-1.html
https://www.knowpia.com/s/blog_60f7e7c31014a97a
https://zenwriting.net/replicawatches24/hin...ica-rolex-watch
https://globalcatalog.com/replicawatchesuk.us/en
http://www.cplusplus.com/articles/iE1wvCM9/
https://eatsleepride.com/c/346210/hints_on_...ica_rolex_watch
https://www.myminifactory.com/users/watcheshutukcom
https://www.mioola.com/ReplicawatchesUK/post/199764/
https://en.gravatar.com/allreplicawatches24
https://8tracks.com/replicawatchesuk
Участник оффлайн! watchesonline89
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  26.12.2022 11:23     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #26 множественное цитирование

https://telegra.ph/Advantages-Of-Replica-Watches-08-03
https://issuu.com/home/published/_6_.docx
https://www.gta5-mods.com/paintjobs/watchesswiss
https://omegawatches89.onweb.it/
https://padlet.com/omegawatches89/je3eq9ol3xzmb9bp
https://www.pinterest.com/omegawatches89/
https://knowyourmeme.com/users/omegawatches89
https://bitcointalk.org/index.php?topic=76487.new#new
https://omegawatches89.blog.hu/
https://knowyourmeme.com/forums/general/top...f-so-why?page=1
https://penzu.com/p/c6f21f5d
https://www.reddit.com/user/omegawatches89/...are_so_popular/
https://www.vingle.net/posts/4647076
https://penzu.com/p/c68b65cc
https://diigo.com/0pige9

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 29.03.24 00:41
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft