Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
jelenarus |
Очень много геномной ДНК на геле 1%, при чем, что ставлю ПЦР я на плазмиду (выделяла ее из ночной культуры набором для выделения плазмид от евроген) в чем может быть проблема и как избежать этого? Картинки: qjsxNE7QVj0.jpg — (107.32к) |
MMM Постоянный участник |
Или после выделения? После нейтрализующего раствора творожистый осадок был? |
jelenarus |
(MMM @ 21.06.2018 22:52) Это уже после ПЦР Да, был |
X34 Участник |
|
MMM Постоянный участник |
(jelenarus @ 21.06.2018 23:19) Концентрацию ДНК после выделения плазмиды измеряли? Форез выделенной плазмиды делали? Зачем вообще выделяли плазмиду, а не делали ПЦР просто с колонии после лизиса кипячением. |
genseq Постоянный участник |
Попробуйте поставить ПЦР с той же матрицей (плазмидой), но разведённой в 1000, 10000 и 100000 раз. Если в плазмиду встроился искомый ген или фрагмент ДНК (и если праймеры не кривые), то ампликон на форезе проявится. |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
Две причины, даже три: 1. переизбыток матрицы. Генсек предлагает разбавить в 100 000 раз, а я - еще больше! Если концентрация плазмиды (чего проще указать сколько матрицы внесли в реакцию ) 100 нг/мкл, можете разбавлять её в 100 000 000 раз и делать 33-35 циклов... 2. горбатые праймеры или сложная вторич. структура ампликона (с повторами, шпильками с 5- штрих выступающими концами и т.п.)... 3. не известно от чего. У меня тоже бывает такое с идеальными праймерами, с той же оптимизированной системой и лучшими полимеразами и на тебе шмеры регулярные. В этом случае я переделываю праймеры и все. Танцевать с бубнами нам некогда - жизнь так прекрасна, но так коротка! |
R-J-Dio Постоянный участник |
Сообщение было отредактировано yack - 22.06.2018 17:32 |
Carbon Copy Постоянный участник So close no matter how far |
genseq - Хорош ужасы рассказывать про однонитевые хвосты. В большинстве случаев высокая концентрация ДНК просто ингибирует ПЦР и всё. |
guest: petr IP-штамп: frESYufl5slOA гость |
|
jelenarus |
(guest: petr @ 27.06.2018 17:36) Мне кажется там и праймеры хорошо бы развести. Там какой-то ацкий перегруз не только по матрице, но и по праймерам. jelenarus, сколько праймеров вы кладете в ПЦР? 2,5 мкл на 50 мкл смеси, финальная концентрация 0,5 мкМ |
MMM Постоянный участник |
|
jelenarus |
(MMM @ 27.06.2018 19:07) Никогда не ставила форах плазмиды чистой. Как ее кидать, просто, без разведений или как? Сколько мкл? |
jelenarus |
|
MMM Постоянный участник |
(jelenarus @ 27.06.2018 19:29) Это настораживает! Ну нанограмм 100-500 на дорожку достаточно под BrEt. |
guest: petr IP-штамп: frESYufl5slOA гость |
(jelenarus @ 27.06.2018 18:06) Хм... странно, вроде нормальная концентрация. МОжет праймеры димеризуются. Сиквенсы праймерров в студию pls. |
R-J-Dio Постоянный участник |
(jelenarus @ 27.06.2018 19:29) Никогда не ставила форах плазмиды чистой. Как ее кидать, просто, без разведений или как? Сколько мкл? вау!!! конец цитаты |
jelenarus |
(R-J-Dio @ 28.06.2018 01:26) вы так нетерпимы... |
R-J-Dio Постоянный участник |
|
NMR-guy Постоянный участник временной жизни |
|
R-J-Dio Постоянный участник |
|
jelenarus |
(guest: petr @ 27.06.2018 22:41) Хм... странно, вроде нормальная концентрация. МОжет праймеры димеризуются. Сиквенсы праймерров в студию pls. F 5'-3' ggacggacatCTAGACATTGAAGTCCTGATTTATC R 5'-3' gtgtgattgaCTTCTGAGGCGGAAAGAAC |
R-J-Dio Постоянный участник |
|
guest: petr IP-штамп: frESYufl5slOA гость |
(jelenarus @ 29.06.2018 14:45) Хм... Да, вполне себе нормальные. Тогда хорошо бы, как уже и говорили, после выделения на саму плазмиду в геле посмотреть. |
watchesonline89 Постоянный участник |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |