Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
metrim Постоянный участник Москва |
Т.е. грубо говоря - в лунку "стандартного" агарозного геля залить ON-культуру и из неё что бы вышла рРНК в гель. Вроде как бОльшая часть рибосомальных белков будет при этом заряжена положительно, у них pI существенно выше 8,3. Неутянут ли они рРНК в противоположную сторону? Нужно ли вносить в гель какие то модификаторы, денатурирующие агенты, что разрушить РНК-белковый комплекс? (по условиям задачи внести детергенты в суспензию , кипятить и пр - неприемлемо) Может быть самого электрического поля будет достаточно, что бы разрушить все супрамолекулярные комплексы? |
ship Постоянный участник Moscow |
|
metrim Постоянный участник Москва |
(ship @ 03.07.2018 12:36) Не буду спорить. Вообще "эксперимент" предполагается не совсем в таком виде, но в целом - экстакция нуклеиновых кислот из клеток в гель. Опыта у меня в данном аспекте нет , вот и спрашиваю более подкованных. Клетки то какие? Как РНК-белковые комплексы через клеточную мембрану или стенку выйдут? ну метод "комет" же как то работает ? Клетки бактериальные прежде всего (пардон что забыл указать), ну и микромицеты.
|
ship Постоянный участник Moscow |
@Проводится иммобилизация, подвергнутых воздействию изучаемого фактора клеток в низкоплавкой агарозе, нанесенной на предметное стекло для микроскопии. Обработка образцов в буфере с высоким содержанием соли приводит к лизису клеточных мембран и экстракции белков. @ клетки лизировать надо для метода комет. |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
Сейчас модно обрабатывать бакт.клетки, т.е. ресуспендировать после ЦФ в буфере, содержащем РНК-азу А перед щелочным лизисом, и в итоге действительно плазмидная ДНК получается полностью свободная от всей РНК... |
metrim Постоянный участник Москва |
В целом прикидваю: возможно ли реализовать метод визуализации микробных сообществ in situ. Получать отпечатки поверзности, на которой растут микробы на гелевой пластине, а затем - переносить РНК методом блоттинга СКВОЗЬ гель на мембрану. Затем - алалогично FISH . Вполне возможно эта задача уже более чем удачно кем то решена, буду признателен за ссылки на статьи и методички |
NMR-guy Постоянный участник временной жизни |
Либо Вы крошитё всё в хлам и из гомогенного хаоса тащите конкретно РНК (с ингибированием вырвавшихся на свободу РНКаз в хаосе), либо, если не крошите всё в хлам - то имеете дело с артефактами метода Вашего прессования-электрофореза разной интенсивности, а не с результатами собственно бактериального распределения по "карте". Стабильность части РНК в клетках - десятки секунд. Вы не успеете её вытащить из мешка, где её грызут ферменты за это время, если не устроите всему без разбора полный квенч каким-нибудь хаотропом с детергентом и протеиназой К (например). |
ship Постоянный участник Moscow |
(metrim @ 03.07.2018 11:49) Да нет никакой "великой тайны", просто не хочется отвлекаться на "посторонние" на данном этапе вопросы. В целом прикидваю: возможно ли реализовать метод визуализации микробных сообществ in situ. Получать отпечатки поверзности, на которой растут микробы на гелевой пластине, а затем - переносить РНК методом блоттинга СКВОЗЬ гель на мембрану. Затем - алалогично FISH . Вполне возможно эта задача уже более чем удачно кем то решена, буду признателен за ссылки на статьи и методички А зачем сквозь гель переносить? Ну по сути вам надо делать Нозерн-блот, только без электрофореза. Типа растите клетки на подложке, а затем все фиксируете и денатурируете , и переносите РНК на мембрану, и затем гибридизуете мембрану с зондами. Но зачем это делать по РНК когда можно и по геномной ДНК различать разных микробов?
|
NMR-guy Постоянный участник временной жизни |
|
metrim Постоянный участник Москва |
(NMR-guy @ 03.07.2018 16:19) Стабильность части РНК в клетках - десятки секунд. Вы не успеете её вытащить из мешка, где её грызут ферменты за это время, если не устроите всему без разбора полный квенч каким-нибудь хаотропом с детергентом и протеиназой К (например). НУ а ЭДТА не спасет РНК в данном случае?В гель по идее можно заправить что угодно,что бы подавить активность нуклеаз. Ну а уже мембрану, после переноса, можно обработать протеазами. |
metrim Постоянный участник Москва |
(ship @ 03.07.2018 17:11) Типа растите клетки на подложке, а затем все фиксируете и денатурируете , и переносите РНК на мембрану, и затем гибридизуете мембрану с зондами. В том то и дело, что я ничего не хочу растить. Мне нужно перенести "микробиом" с некоей поверхности на мембрану.Но зачем это делать по РНК когда можно и по геномной ДНК различать разных микробов? Мне не нужно "идентифицировать", делать дот-блот и т.д. Ну вот что бы было понятнее |
NMR-guy Постоянный участник временной жизни |
(metrim @ 03.07.2018 22:05) НУ а ЭДТА не спасет РНК в данном случае? В гель по идее можно заправить что угодно,что бы подавить активность нуклеаз. Ну а уже мембрану, после переноса, можно обработать протеазами. ЭДТА лишь будет элементом артефакта, накладывающим маску на реальное распределение бактерий. Поскольку ЭДТА будет иметь РАЗНУЮ подвижность и глушить нуклеазы из разных бактериальных тел с разной эффективностью. В результате у Вас будет не микробиом а "кто лучше всех заглушился тот и отпечатался лучше всех". Вам нужно придумать каким образом за несколько секунд сделать из поверхности Вашего микробиома тотальную кашу, но при этом не повредив химически РНК. Это весьма сложная задача, решенная лишь для смывов, но никак не для произвольной поверхности в коллоидной или твёрдой фазе. |
metrim Постоянный участник Москва |
(NMR-guy @ 04.07.2018 10:01) ЭДТА лишь будет элементом артефакта, накладывающим маску на реальное распределение бактерий. Поскольку ЭДТА будет иметь РАЗНУЮ подвижность и глушить нуклеазы из разных бактериальных тел с разной эффективностью. В результате у Вас будет не микробиом а "кто лучше всех заглушился тот и отпечатался лучше всех". Не очень понял, почему ЭДТА будет иметь в данном случае "разную подвижность". Кончентрация его вроде везде равномерное, так же как и электрическое поле. В том то как бы в моем представлении и прелесть, что "получаем на агаровой подложке отпечаток микробиома, толщиной несколько микрометров, а потом осуществляем его блоттинг".Вам нужно придумать каким образом за несколько секунд сделать из поверхности Вашего микробиома тотальную кашу, но при этом не повредив химически РНК. Это весьма сложная задача, решенная лишь для смывов, но никак не для произвольной поверхности в коллоидной или твёрдой фазе. Как бы то что "нельзя внести детергенты в образец" - я как бэ утрировал, разумеется можно фильтровалку с буфером, снабжённым детергентом или чем угодно на гель наложить, что бы решить задачу быстрой инактивации нуклеаз. Ну в любом случае, промежуточный результат получен, мне разом категорически не сказал "да ты чо чувак, да все это уже давно обтяпано и делается на потоке", #RTFManiatis Если у кого то появится интерес к решению означенной задачи, но нет желания молоть языком на форме - можно связаться через ЛС и на условиях соавторства - помочь мне сделать работу. Все основные биохимические реактивы и оснащение у меня наличествуют |
NMR-guy Постоянный участник временной жизни |
(metrim @ 22.07.2018 15:00) Поскольку скорость её диффузии не будет подчиняться классическим законам в растворе по дороге к РНКазам в ваших бактериях. На диффузионное поле наложится маска разных клеточных образований в разное количество слоёв, которые непроницаемы для ЭДТА, но проткнуты различным числом специфических каналов и пор, прикрыты разной гликановой "шубой" и по-разному (с разной эффективностью в единицу времени) разрушаемы хаотропными агентами типа гуанидина. При этом внутри этих мешков уже всё перемешано и РНК благополучно доступно для РНКаз, как и для разрывов нити. Ферменты репарирующие РНК, наколько я помню, наукой не обнаружены. Таким образом, Вы получаете оттиск не микробиома своего, а маскировки его Вашим протоколом выделения, если не будете действовать БЫСТРО, химически аккуратно по отношению к РНК и радикально. То есть - не превратите всё вообще в лизат/раствор за секунды, с заквенченными ЭДТА и другими ингибиторами РНКзами. Патенты и ноу-хау на РНКазные квенчи и киты для выделения весьма дорогого стоят как раз из-за весьма высокой трудоёмкости борьбы за эти секунды до равномерного квенча в многофазовой коллоидной лизисной среде при выделении РНК. Это всегда сложные смеси с весьма узкими диапазонами эффективной, но при этом не разрушающей РНК работы. |
Vadim Sharov Постоянный участник Россия |
Говорят, исследователи почв для генотипирования используют анализ генов рРНК. Поскольку скорость её диффузии не будет подчиняться классическим законам в растворе по дороге к РНКазам в ваших бактериях. Шедевр! Отлито в граните! Вообще то, ингибирующий эффект ЭДТА не в прямом взаимодействии с РНКазами, а в связывании кофактора РНКазы - магния и других двухвалентных металлов. Кстати, не все РНКазы магний зависимые. |
NMR-guy Постоянный участник временной жизни |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(Vadim Sharov @ 24.07.2018 12:43) Вообще то, ингибирующий эффект ЭДТА не в прямом взаимодействии с РНКазами, а в связывании кофактора РНКазы - магния и других двухвалентных металлов. Кстати, не все РНКазы магний зависимые. ЭДТА еще никому не удалось РНК-азы ингибировать, ни одну, даже эндо... На магний им плевать. Поверхностные знания, дилетанские. |
NMR-guy Постоянный участник временной жизни |
Также господин-ъ- Шаров-ъ- забыл (наверное по своей чудовищной занятости более важными делами), что свободного магния и марганца внутри клеток бактерий почти нет, всё хелатировано, в том числе - как кофакторы в активных центрах. Потому и "на магний им плевать" и "ЭДТА прямо к самим РНКазам нужно подавать". |
Vadim Sharov Постоянный участник Россия |
(-Ъ- @ 24.07.2018 13:51) ЭДТА еще никому не удалось РНК-азы ингибировать, ни одну, даже эндо... На магний им плевать. Поверхностные знания, дилетанские. Скажем так, в растворе некоторые РНКазы частично магний зависимы и активность фермента может быть снижена ЭДТА. В растворе и некоторых А так, сожрут РНК что с магнием, что без. Но при этом ЭДТА разрушает, через связывание магния, как структуру НК, так и комплекс белок-НК открывая РНК для атаки РНКазами. Замечу, что и РНКазин долго не спасет без категоричного освобождения от клеточных белков. Главный мой вопрос так и не отвечен. Зачем для генотипирования рРНК |
Vadim Sharov Постоянный участник Россия |
(NMR-guy @ 24.07.2018 16:17) Также господин-ъ- Шаров-ъ- забыл (наверное по своей чудовищной занятости более важными делами), что свободного магния и марганца внутри клеток бактерий почти нет, всё хелатировано, в том числе - как кофакторы в активных центрах. Потому и "на магний им плевать" и "ЭДТА прямо к самим РНКазам нужно подавать". О сколько нам открытий чудных излучают великие специалисты. Меня когда то учили, что металлы не связываются ковалентно в активных центрах, кто будет металл "хелатировать" зависит от константы ассоциации я магния и кальция. Что в белке, что ЭДТА. обычно вносят порядка на три больше чем белка, что даже если и КА выше у белка, все равно равновесие будет сдвинуто в сторону комплекса металла с ЭДТА. Конечно, пока мембран нативна, ЭДТА не пройдет через неё. Но Вы же собираетесь рРНК из клетки дернуть. В гель под током. Кстати, интересно, как Вы всерьез пишите про весь связанный магний бактерий из которых под действием электрического тога в гелевой раствор вытягивают рРНК. Или у Вас супертонкий супернаногель. Тонкий тонкий. Куда ЭДТА сыпать будете? Как ток подведете? Ой, забыл, надо на молекулярно-биологическом форуме включить Муханкина-Горяева и начать витийствовать, что свободных воды и металлов нет, а также вообще в клетке гель и законы другие. Как они (вученые) только в клетке определяют концентрации связанных и свободных кальция, магния, рН. Усё врут ученые. Кстати, Вы сделали великое открытие. Я, наивный, думал, что магний в бактериях, в основном, в комплексе с нуклеиновыми кислотами, а не в активных центрах. Ан, нет, вон оно как, Петрович |
NMR-guy Постоянный участник временной жизни |
Вадим, расслабьтесь, мы человеку помочь пытаемся вроде, а не доказать кого и где лучше учили (понятное дело - Вас лучше, все остальные неучи и ППГ, Вы же все после МГУ в бЕлом всегда). Я писАл про то, что если человек рассчитывает ЭДТА заингибировать РНКазу (что, я согласен,- дело малоперспективное), то не стоит обольщаться, что ЭДТА будет в окрестности ВСЕХ РНКаз в растворе для того, чтобы отнять у них себе весь магний и типо их немного заингибировать. Это же справедливо и для каких-либо других ингибиторов. Вопрос можно ли электрофорезом вытащить из бактерий магний и другие ионы - чисто экспериментальный. Не уверен, что это получится опять же из-за мембран. Через которые весьма энергозатратно таскать ионы. |
Vadim Sharov Постоянный участник Россия |
Что не стоит обольщаться, что ЭДТА будет в окрестности ВСЕХ РНКаз в растворе Вот как раз маленькая молекула в растворе будет довольно быстро везде. Или в бактериях есть особые компартменты. Тела включения? Ага, с рРНК. Споры? ОК. В споры ЭТА не попадет до их разрушения. Вам не хватит рРНК из цитозоля? Но вернемся к главному, зачем выдергивать рРНК из клеток для изучения почвенного ландшафта? Генотипирования по гену рРНК не хватит? Я уже дал ссылки, как в России это решают, без мегадум про коферменты РНКаз. |
metrim Постоянный участник Москва |
(NMR-guy @ 25.07.2018 01:47) Ну человек пока непосредственно по "выдергиванию РНК" ничего не предпринимал, т.к. нет ни опыта ни нормального соответствующего образования в данной области. Пока что именно перебираю "что может пойти не так и как забороть".Вопрос можно ли электрофорезом вытащить из бактерий магний и другие ионы - чисто экспериментальный. Не уверен, что это получится опять же из-за мембран. Через которые весьма энергозатратно таскать ионы. А разве в электрическом поле как раз для относительно компактных катионов, да в электролите, который представляет из себя цитоплазма движение как раз не станет очень даже простым? Кроме того, ведь можно же садануть ток посолиднее, что в купе с разбавленным электролитом даст изрядный локальный разогрев и поспособствует вскрытию клеток и денатурации белков.Кстати говоря, коли уж так уговаривают "работать с ДНК, а какова будет подвижность геномной бактериальной и грибной ДНК в 1% геле? Спасибо всем кто отзывчиво принимает участие в дискуссии! Некоторых порой правда заносит в тяге показать свое "превосходство" и ученость, полученную из рекламных статей. Надеюсь тяга "утереть сиволапым нос" не затмит им окончательно все и позволит прорваться чему то из далекого научного и лабораторного прошлого |
NMR-guy Постоянный участник временной жизни |
(Vadim Sharov @ 27.07.2018 01:25) Вот как раз маленькая молекула в растворе будет довольно быстро везде. Или в бактериях есть особые компартменты. Тела включения? Ага, с рРНК. Споры? ОК. В споры ЭТА не попадет до их разрушения. Вам не хватит рРНК из цитозоля? Но вернемся к главному, зачем выдергивать рРНК из клеток для изучения почвенного ландшафта? Генотипирования по гену рРНК не хватит? Я уже дал ссылки, как в России это решают, без мегадум про коферменты РНКаз. Бактерии сами по себе закрытые наглухо мешки с 2-3 рубежами непроницаемости, пробитые каналами и активными транспортерами, их внешние барьеры - это не эукариотическая жиденькая мембранка, даже и через которую (целую) ЭДТА небыстро проходит, если вообще. А если metrim ещё не решил что делать ему для своих изобретений, позволю себе совет: забыть про РНК вообще и никогда не вспоминать, а веселиться строго с ДНК. ДНК стабильнее и ДНКазы/рестриктазы заингибировать гораздо проще. Если, конечно, его не интересуют РНК-содержащие вирусы и только они. |
NMR-guy Постоянный участник временной жизни |
(metrim @ 27.07.2018 02:22) Ну человек пока непосредственно по "выдергиванию РНК" ничего не предпринимал, т.к. нет ни опыта ни нормального соответствующего образования в данной области. Пока что именно перебираю "что может пойти не так и как забороть". А разве в электрическом поле как раз для относительно компактных катионов, да в электролите, который представляет из себя цитоплазма движение как раз не станет очень даже простым? Кроме того, ведь можно же садануть ток посолиднее, что в купе с разбавленным электролитом даст изрядный локальный разогрев и поспособствует вскрытию клеток и денатурации белков. Кстати говоря, коли уж так уговаривают "работать с ДНК, а какова будет подвижность геномной бактериальной и грибной ДНК в 1% геле? Спасибо всем кто отзывчиво принимает участие в дискуссии! Некоторых порой правда заносит в тяге показать свое "превосходство" и ученость, полученную из рекламных статей. Надеюсь тяга "утереть сиволапым нос" не затмит им окончательно все и позволит прорваться чему то из далекого научного и лабораторного прошлого Электролит экранирует (пускает энергию поля по себе) замембранные ионы от электрического поля. Посему Вы им таким прямым способом за клеточными стенками и сиало-шубой (которая тоже прекрасный экран, который потащит бактерии по градиенту поля всю целиком, боюсь, а не ионы из её нутра) ни на что не повоздействуете. Если же Вы допустите нагревание, то оно будет, боюсь, неконтролируемым и локально будет переходить точку кипения, что приведёт к денатурации и механическим разрывам энергией тепловых колебаний массивов воды однонитевых молекул к этому довольно нестойких (как и к ультразвуку), грубо: если между двумя денатурированными центрами будет однонитевая связь из РНК, то она механически порвётся. Двунитевую ДНК порвать сильно сложнее. Двунитевая геномка даже до очистки вполне себе двигается, более того, можно различить суперспирализованные плазмиды и хромосомы на геле и их раскрученные и поврежденные изоформы. 1% агароза, 4 часа 100 вольт, 20 см ванночка: пробуйте это для начала. Но, всё же, геномку бактериальную нужно для начала очистить от белков, иначе она даже из колодца не выйдет. Электростатически оторвать ДНК от белков возможно только в 7-молярной мочевине или гуанидине, но в них Вы электрофорез не прогоните, только FPLC, да и то не самого лучшего качества будет. В общем и целом, всё что можно себе представить простого уже попробовано и сделано, многое уже даже вышло из-под патентной защиты. Так что там учёному почти нечего делать. |
watchesonline89 Постоянный участник |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |