molbiol.ru -> Вопрос по иммунопреципитации

> Все форумы > Тематические форумы > Молекулярная и клеточная биология

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ

Правила FAQ* Поиск* Участники* Календарь* Избранные темы* Форум Форумов*

Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ]

Форум:

* Вопрос по иммунопреципитации -- бэнды там, где не должны быть --

Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.

Shuriko
Участник

16.10.2012 18:56

URL #1

Здравствуйте!
Делаю иммунопреципитацию, и что-то странное получается.

Гипотеза: белок А взаимодействует с белком Б при неких индуцирующих условиях.

Эксперимент: клеточная линия трансфицируется плазмидой с геном А, сшитым с Flag'ом, и пустым вектором для контроля. Далее половина клеток подвергается тритменту (индуцирующие условия), половина, соответственно, нет. То есть на выходе имеем 4 варианта белковых лизатов: есть белок/нет белка, есть воздействие/нет воздействия. Лизаты (2 мг) используются для IP с сигмовским Anti-Flag M2 Affinity Gel. То есть белок А цепляется за Flag, а с ним, предположительно, садится белок Б. Извините, если я неправильно употребляю термины, просто раньше не доводилось делать IP.
Потом форез и Вестерн. Порядок действий: антитела на Flag - вторичные, потом антитела на белок Б - снова вторичные. На блоте четко видно, что белок А есть, где должен быть, и отсутствует там, где пустой вектор. Что белок садится на шарики, тоже хорошо видно. Антитела на белок Б показывают слабый, но однозначный бэнд на одной дорожке - (белок А + воздействие). На других дорожках чисто. Да, и на input всё как должно быть. То есть ура-ура, есть взаимодействие, все очень рады.

И решено, естественно, эксперимент повторить. В первой части эксперимента всё так же, только белка чуть побольше (2,5 мг). Но мембрану на этот раз сначала гибридизовали с антителами к белку Б, потом с антителами к Flag, потом со смесью вторичных антител (IRdye 800 и IRdye 680). Чтобы, значит, в разных цветах всё на блоте увидеть.
Ну и увидели. С Flag'ом всё выглядит примерно так же, как в первый раз - белок есть там, где должен быть, и отсутствует там, где не должен. А вот белок Б внезапно появился везде. Независимо от того, есть белок А или нет его, было воздействие или нет. На всех четырех дорожках.

В связи с этим у меня вопрос: это как? Это что, неспецифическое связывание белка Б с анти-Flag бидсами? Или это чьи-то кривые ручки?
И, главное, что делать?

Буду очень, просто очень благодарна за поделение опытом и советы.
Если что-то непонятно изложила - спрашивайте, буду дополнять.

guest: ммм
IP-штамп: frYCOZf7GhDHk
гость

16.10.2012 19:16

URL #2

крута вы блот флуоресцентными антителам красите, интересно как вы потом их выявляете на спец. хемидоке?

--Это что, неспецифическое связывание белка Б с анти-Flag бидсами? Или это чьи-то кривые ручки?

Обе гипотезы вполне разумны. А чтоб исключить вторую бидсы без всего в избытке доолго инкубируют с лизатом, а потом забирают с них супер и уже потом ставят опыт на супере. Ну и вообще лизат с бидсами, а потом смыв и блот покажут вам верна ли эта гипотеза. Мне выше приведенная метода не нравится, я бы постаралься для удаления неспецифики использовать каие-нибудь промывки той или иной жесткости.

Поблагодарили (1): Shuriko

Shuriko
Участник

16.10.2012 19:32

URL #3

Эээ, у нас сканер есть для мембран, Lycor Odissey, по-моему. Вы ведь об этом спрашивали?

Вы про pre-clearing говорите, да? Чтобы всякую неспецифику удалить? Просто я не вполне понимаю, как его делать в случае Anti-Flag M2 Affinity Gel - ведь тут же и специфика вся сядет и уйдет с первой порцией шариков. Или надо c каким-нибудь protein A или G сначала проинкубировать?

>Ну и вообще лизат с бидсами, а потом смыв и блот покажут вам верна ли эта гипотеза
Простите, вы не могли бы пояснить? Что-то я плохо сегодня соображаю

Что касается промывок - промывки были. Лизирующий буфер с CHAPS, четыре промывки по 5 минут. В первом эксперименте всё то же самое было, и никаких "левых" бэндов. Или надо что-то более жесткое?

То есть белок всё-таки может неспецифически садиться на шарики? И что люди делают в таких случаях?

Спасибо огромное за ответ.

xenopus
Постоянный участник
Moscow

16.10.2012 19:44

URL #4

Во-первых, имхо не стоит делать на одном блоте такой дикий замес из антител - могут крестить.
Во-вторых, промывать можно бы и подольше, по крайней мере последнюю промывку. Мы промываем буфером с 1% тритоном.
В-третьих, обязательно ставить контроль на неспецифическое связывание белка Б со смолой (т.е.в отсутствие белка А -flag)
В-четвертых, со смолы лучше смывать flag-пептидом, фон намного меньше.

Поблагодарили (1): Shuriko

Shuriko
Участник

16.10.2012 20:06

URL #5

Спасибо за такой информативный ответ.

Насчет дикого замеса мне тоже так кажется, но в нашей лаборатоии так делают. Но вот уже сказали сделать так, как в первом эксперименте

Насчет промывок поняла, спасибо.
Этот контроль у меня есть - на двух дорожках из четырех нет белка А-Flag. А связывание есть. Непонятно, почему в первом эксперименте ничего такого не вылезло.
Flag-пептидом, говорите... Ок, буду разбираться. Спасибо еще раз!

guest: ммм
IP-штамп: frYCOZf7GhDHk
гость

16.10.2012 20:11

URL #6

-Простите, вы не могли бы пояснить? Что-то я плохо сегодня соображаю

У вас клетки не трансформированные есть?
Делаете из них лизат и инкубируете с с флаг-смолой все каа в опыте потом форез блот на белок Б.

Shuriko
Участник

16.10.2012 20:27

URL #7

>У вас клетки не трансформированные есть?

А, этого добра у меня навалом... Спасибо, теперь всё поняла.

ship
Постоянный участник
Moscow

17.10.2012 13:05

URL #8

было бы хорошо посмотреть картинки. какие молвеса белков А и Б? букв много, все непрочитал, но если ппоявилась полоса во всех дорожках, то может это сигнал от вторичных антител ? первичные антитела к белку Б мышиные?
про элюцию пептидом лучше забыть -хреново элюирует, сработает если белка сел вагон.
ну и конечно стоит делать блоты отдельно - на белок А и белок Б. лить все в кучу - только грязи добавится.

Guest
IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2
гость

17.10.2012 13:17

URL #9

https://products.invitrogen.com/ivgn/produc...BC-DYNAL-14302D

Shuriko
Участник

17.10.2012 17:35

URL #10

To ship:
Белок А примерно 57 кДа (вместе с флагом), белок Б - 70 кДа. Но 10% геле разделяются нормально. На белок А антитела мышиные, на Б - кроличьи.
Картинки постараюсь выложить, но у меня Интернет очень хреновый, не уверена, получится ли с работы.

Спасибо за ответ!

VKV
Участник

17.10.2012 19:43

URL #11

To Shuriko
В голову пришла одна мысль: у вас после IP скорее всего лизаты будут загрязнены мышиными антителами, так как Anti-Flag M2 Affinity Gel содержит мышиные анти флаг антитела, и если одно из вторичных антител anti mouse - то может подсвечиваться 2 бэнда - 55 kDa - тяжелая цепь и 25 kDa - легкая

Tom1
Постоянный участник

17.10.2012 20:26

URL #12

внесу свои 2 цента
если будите смывать флаг пептидом следует брать примерно в пять раз больше чем рекомендуют.
и после елюции бидзы не выбрасывать, а тоже на блот короче доубле работа...
правильно напейсал "корабль" еффиктивность стремится к нулю...
имха надо делать исчо один контроль "мок ИП" т.е. ИП просто антителами в данном случае мышиными
как-то таг.
пы.сы. подумалось что исчо одно склизкое место индукция....

Shuriko
Участник

17.10.2012 20:42

URL #13

To VKV:
Вы правы, и они таки там есть, но мой белок (который А) идет выше, и его видно. Поскольку второй белок весит 70, ему это по идее вообще не должно мешать.

To Tom1:
Спасибо за советы.
Смываю я банально добавлением loading buffer с SDS и старым добрым кипячением. Что, возможно, не очень хорошо.
Flag-пептида у нас все равно нет, так что пока я думаю про увеличение времени отмывок и может быть о повышении соли в буфере. 1%-й Triton X-100 как-то страшновато использовать, смоет же всё начисто, что нужно и что не нужно.

Не совсем поняла насчет контроля. В смысле, сделать IP с protein G и антителами на флаг, используя лизат из нетрансформированных клеток, и посмотреть, будет ли то же самое?

ship
Постоянный участник
Moscow

17.10.2012 20:53

URL #14

я так понял что вы и ИП и Вестрен ставите с m2 anti-flag антителами?
раз белок В 70 кДа -то антитела мешать не должны.

на самом деле если у вас при первых условиях все работает, то и делайте так. зачем изголяться с какимито флуоресцентными вторичными, да еще и их смесью?

Tom1
Постоянный участник

17.10.2012 21:03

URL #15

имелось ввиду вот такие антитела...
http://www.scbt.com/datasheet-2762-normal-mouse-igg-b.html
обычно "мыл " ип ПБС+1М соль и до 1% тween-20 он вроде как помягче чем тритон....
выделяя комплекс из более 15 белков и нормально работало.....

Поблагодарили (1): Shuriko

Shuriko
Участник

17.10.2012 21:05

URL #16

Нет, IP с m2 anti-flag, а Вестерн с другими, но тоже мышиными.

Да, согласна, что если работает, то ничего менять не надо

Но в первый раз вторичные были тоже флуоресцентые, просто шли последовательно, а не в смеси, и через несколько отмывок.
Ну, поскольку по-любому надо повторять, посмотрим, что получится первым способом.

ship
Постоянный участник
Moscow

17.10.2012 21:57

URL #17

просто у сигмы есть rabbit anti-flag, хорошо и чисто работают на вестерне, и к тому же кроличьи. ИП мышиными, блот кроличьими.
а простые антитела есть у вас? ну там HRP или AP -меченные? я бы лучше все делал с такими. ну а уж ппотом когда все работает -если очень хочется то можно с цветными)))

Поблагодарили (2): VKV, Shuriko

Tom1
Постоянный участник

17.10.2012 22:09

URL #18

(ship @ 17.10.2012 11:57)

+1000

Поблагодарили (1): VKV

Guest
IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2
гость

18.10.2012 11:19

URL #19

(ship @ 17.10.2012 21:57)

просто у сигмы есть раббит анти-флаг, хорошо и чисто работают на вестерне, и к тому же кроличьи. ИП мышиными, блот кроличьими.
а простые антитела есть у вас? ну там ХРП или АП -меченные? я бы лучше все делал с такими. ну а уж ппотом когда все работает -если очень хочется то можно с цветными)))

чем цветные плохи ?
чувствительность ?
http://www.licor.com/bio/products/reagents...otting_kits.jsp

ship
Постоянный участник
Moscow

18.10.2012 12:54

URL #20

(Guest @ 18.10.2012 09:19)

чем цветные плохи ?
чувствительность ?
http://www.licor.com/bio/products/reagents...otting_kits.jsp

в каталогах и рекламах всегда сладко поют.
чем плохи? не у всех есть девайсы, плюс к девайссу -фильтры нужны соответсвующие. цена я уверен существенно выше, хотя на сайте не указано (первый кит на десять блотов всего).

на счет чувствительности - думаю что у HRP-cconjugated она будет выше, но это надо своими руками сравнивать.

они показывают картинку лизатов, крашенных на мажорные белки. а что будет при коИП?

Сообщение было отредактировано ship - 18.10.2012 12:59

Guest
IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2
гость

18.10.2012 13:04

URL #21

(ship @ 18.10.2012 12:54)

в каталогах и рекламах всегда сладко поют.
чем плохи? не у всех есть девайсы, плюс к девайссу -фильтры нужны соответсвующие. цена я уверен существенно выше, хотя на сайте не указано (первый кит на десять блотов всего).

на счет чувствительности - думаю что у ХРП-ццонюгатед она будет выше, но это надо своими руками сравнивать.

они показывают картинку лизатов, крашенных на мажорные белки. а что будет при коИП?

у Ликера два инфракрасных красителя , как в ихнем сиквинаторе двухцветном и филтры ессессно внутри прибора - Одиссей - это сканнер гелей

Guest
IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2
гость

18.10.2012 13:16

URL #22

(ship @ 18.10.2012 12:54)

http://www.licor.com/bio/products/imaging_...ssey_imager.jsp

Guest
IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2
гость

18.10.2012 13:19

URL #23

(ship @ 18.10.2012 12:54)

http://www.licor.com/bio/applications/inGe...ernOverview.jsp

Guest
IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2
гость

18.10.2012 13:34

URL #24

(ship @ 18.10.2012 12:54)

в каталогах и рекламах всегда сладко поют.
чем плохи? не у всех есть девайсы, плюс к девайссу -фильтры нужны соответсвующие. цена я уверен существенно выше, хотя на сайте не указано (первый кит на десять блотов всего).

на счет чувствительности - думаю что у ХРП-ццонюгатед она будет выше, но это надо своими руками сравнивать.

они показывают картинку лизатов, крашенных на мажорные белки. а что будет при коИП?

утверждают , что чувствительность как хемилюминесценция или выше
http://www.licor.com/bio/products/imaging_...sensitivity.jsp

Guest
IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2
гость

18.10.2012 13:51

URL #25

(ship @ 18.10.2012 12:54)

в каталогах и рекламах всегда сладко поют.
чем плохи? не у всех есть девайсы, плюс к девайссу -фильтры нужны соответсвующие. цена я уверен существенно выше, хотя на сайте не указано (первый кит на десять блотов всего).

на счет чувствительности - думаю что у ХРП-ццонюгатед она будет выше, но это надо своими руками сравнивать.

они показывают картинку лизатов, крашенных на мажорные белки. а что будет при коИП?

может проблема в том , что Одиссей слишком чувствителный

http://biosupport.licor.com/docs/CLx_Digital_Brochure2.pdf

xenopus
Постоянный участник
Moscow

19.10.2012 12:48

URL #26

(ship @ 17.10.2012 11:05)

про элюцию пептидом лучше забыть -хреново элюирует, сработает если белка сел вагон.

Не знаю, у нас все работает со свистом. Буквально вчера делал Ко-ИП, нормальная картинка получилась.

Единственное что - флаг-пептида действительно мы берем в 3-4 раза больше, чем в букваре. Прошу прощения, забыл сразу об этом сказать. Можно и смывать и сэмпл-буфером, но так фон иногда вылезает. С пептидом таки чище. Если фона нет, то и заморачиваться с пептидом нет смысла.

watchesbiz
Постоянный участник

08.12.2021 16:40

URL #27

https://www.uptrennd.com/post-detail/hints-...-watch~ODY3MDU2
https://anotepad.com/note/read/mqg8p5jm
https://www.crokes.com/replicarolexwatches/profile/
https://ko-fi.com/post/Watches-Shopping-Gui...-Watc-E1E13PZV9
https://www.merchantcircle.com/blogs/replic...x-Watch/1966540
https://www.nairaland.com/6427528/watches-s...de-finding-fake
https://www.vingle.net/posts/3587193
https://fortunetelleroracle.com/sport/replica-watches-280478
https://www.goodreads.com/story/show/132736...ake-rolex-watch
https://www.diigo.com/item/note/85twz/phwr?...2395edb2dac07ea
https://github.com/ReplicawatchesUK/Replica...ake-Rolex-Watch
https://www.reddit.com/user/Bestreplicawatc...ke_rolex_watch/
https://slashdot.org/submission/13306958/wa...ake-rolex-watch
https://www.wattpad.com/1030107359-replica-...guide-finding-a
https://www.instructables.com/member/Fakero...licPreview=true

Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.

Имя:

Отправка сообщений использует JavaScript операции. В вашем броузере не
установлено/отключено выполнение JavaScript программ. Используйте Netscape Navigator
или Internet Explorer (не ранее 3 версии); убедитесь, что выполнение JavaScript
программ разрешено в настройках вашего броузера.