Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
12 | Отправлен 11.06.2022 10:34 |
Saxon Mullins |
|
guest: 123 | Отправлен 09.06.2022 09:35 |
Elon Musk has |
|
guest: 123 | Отправлен 08.06.2022 12:57 |
South Korea |
|
guest: 123 | Отправлен 31.05.2022 09:11 |
SINCE LAUNCHING |
|
KCN | Отправлен 11.12.2018 10:36 |
Да, для тех кто сомневается в том, что HPLC пригодна для работы с белками, причем не только для аналитики но и минипрепаратива и даже препаратива: 1. The Handbook of Analysis and Purification of Peptides and Proteins by Reversed-Phase HPLC, the Grace Vydac Technical Support Group. 2. The Handbook of Analysis and Purification of Peptides and Proteins by Reversed-Phase HPLC Presented by Vydac (The Separations Group). 3. HPLC of Peptides and Proteins: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) Hardcover – December 15, 2003 by Marie-Isabel Aguilar 4. Руководства к колонкам Zorbax 300SB-C18, SB-C18, SB-300 C8, 300 SCX, ODS C18, Zorbax phenyl , GF-450, GF -250, Eclipse XDB-C18, TSK SP-5PW , TSK G3000SW, TSK CM-3SW, 4.6/9.4 mm и толще, толще... |
|
guest: great | Отправлен 31.10.2018 16:27 |
Superbly written article, if only all bloggers offered the same content as you, the internet would be a far better place. |
|
KCN | Отправлен 24.10.2018 11:50 |
Вот, собственно, ссылки по валидации очистки рекомбинантного белка от ДНК клеток хозяина. Надеюсь, будут полезны тем, кто идет по этому тернистому пути. Методики: qPCR в большинстве случаев, реже гибридизация с Р32 меченой ДНК, спектрофотометрия, преципитация ДНК белками. USP USP 29, 1045, biotechnology-derived articles EP 1.9.2.25 Residual Host Cell DNA (Characterization) ICH ICH Q6B Specifications , p 473, 2017. FDA NCBI RG Коммерческие решения и патенты WHO |
|
KCN | Отправлен 11.10.2018 15:36 |
Выбрал две минипрепаративные колонки с С18, хочу попробовать еще и на них. Если куплю их и что получится - отпишусь. Choose: 80Å for < 4 - 5 kD 300Å for > 4 - 5 kD 1. Protein Separations Reversed-Phase Columns C18 StableBond (80Å) Reversed-Phase HPLC Columns ZORBAX StableBond Columns (80Å) Ordering Information Semi-Preparative 9.4x250 mm,5 mkm, 880975-202 2.Protein Separations Reversed-Phase Columns C18 ZORBAX StableBond (300Å) Column Ordering Information Semipreparative 9.4x250 mm, 5 mkm, 880995-202 Притом для пептидов и белков производители рекомендуют С18, фенилку считают менее подходящим вариантом. И система буфер1/буфер2+ацетонитрил %, с вариациями с ТФУ. А не 2М (NH4)2SO4/ddH2O и фенилка. |
|
KCN | Отправлен 11.10.2018 14:41 |
Что касается работы с белками, с молекулярными массами 1- 50 кДа и более, не только с пептидами, привожу ссылки на документы производителя Agilent 1100 , колонки Zorbax: Хорошие колонки для работы: 9.4 мм и 21.2 мм в диаметре - это минипрепаративные и препаративные колнки, позволяют очистить от 15 до 50 мг материи. НО: на прибор Agilent 1100 производитель НЕ рекомендует ставить колонки "толще" 9.4 мм, т.е. только минипрепаративные. Ну, мне достаточно. Притом для пептидов и белков рекомендуют С18, фенилку считают менее подходящим вариантом. P.S.: Протокол чистки трипсином, может кому понадобится: 180 минут со скоростью подачи трисового буфера рН 7.4 0.15 мл/мин, инъекция трипсина ( до 1 мкг/мл), 100 мкл, температура 36С, колонка 4.7x250 мм. Чиститься отлично, после трипсина можно промыть градиентом буфер/30% изопропанол, со скоростью 0.3 мл/мин, так как изопропанол очень вязкий, вымывает остатки трипсина и пептиды. |
|
KCN | Отправлен 08.08.2018 11:47 |
FPLC чаще используется для белков, HPLC - для низкомолекулярных веществ. Но когда мне надо проанализировать пептиды или белки я так же использую HPLC. Например фибринопептиды А и В , методика по Henshen. Или к примеру b-beta-N-domen, alpha-C-region фибриногена. Это уже домены 14-12 кДа. Более того, белки можно выделить и отнести на масспектр. Для zorbax du pont instruments колонки с фенильной прививкой , оказалось возможным получать микрограммы очень чистых белков и пептидов из плазмы крови или из фибриногена после черновой очистки центрипрепом, FPLC , осаждением фибрина/фибриногена температурой 54-58C. Эти фракции можно не только анализировать на масспектре, но и колоть мышками для иммунизации. Так же неплохо почистился вышеуказанный рекомбинантный белок (54 кДа). Если важна чистота пептида или белка о примесей, отличающихся на пару аминокислот и дающих перекрестную реакцию на моноклонах - HPLC годный вариант, лучше чем FPLC. И если у вас этого белка очень мало - порядка микрограмм. В остальных случаях я использую FPLC. Если колонка забивается белком, например остатками фибриногена, я обычно прокачиваю трипсином в соответствующем буфере, и оставляю в нем систему на ночь. Утром промывают и все работает. Больше всего мне нравится возможность различать белок на C18-C8-фенилке и других колонках этого типа при разнице в одну аминокислоту, даже незаряженную. И связка HPLC-масспектр себя хорошо зарекомендовала. Для рекомбинантных пептидов и белков есть смысл ставить предколонку. Набивают ее при помощи FPLC packing chamber, если набить вручную высокое давление спрессует сорбент и будет пузырь с буфером. Пакующая камера позволяет не пускать сорбент в буфере через насос FPLC, а выдавливать его в колонку или предколонку как из шприца. Есть специальные аппараты для паковки колонок и предколонок, но они дороже чем пакующая камера и узкоспециализированны. В них нет особого смысла. Если предколонку забьет ДНК, ее можно отсоединить от колонки и промыть буфером с ДНКазой, оставив так же на ночь. Это я пока не пробовал. |
|
Посмотреть тему (откроется в новом окне) | |