Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Anastasia Buziashvili |
Собираю все необходимое для постановки Вестерн блот анализа. Нужная аппаратура в нашей лаборатории есть - форезная камера, аппарат для переноса, материалы в процессе сборки - все для буферов-гелей есть, антитела есть (первичные и вторичные, конъюгированные с пероксидазой хрена), нитроцеллюлозные мембраны и реактивы для проявки (люминол, кумаровую кислоту) заказали. Темная комната у нас тоже есть. Теперь вопрос. Как результаты вестерн блот анализа переносить с нитроцеллюлозной мембраны на фотопленку? Что для этого нужно, как проводить саму методику (пожалуйста, если кто этим занимался, можете поделиться ссылкой на рабочую методику?). И где, хотя бы теоретически, можно найти нужные материалы для проявки результатов Вестерн блота на фотопленку? |
Tom1 Постоянный участник |
посему по первоначалу рекомендую купить су бстрат для проявления пероксидазы прямо на мембране.... |
MMM Постоянный участник |
А красный фонарь? Надо приобрести рентген пленку исключительно медицинскую и максимально возможной чувствительности. Внимание! Пленка для дефектоскопии не подходит ни в коем случае. Пропись субстрата люминол/пара-кумаровая найдете в сети. Мембрану после инкубации ополоснуть в воде. Бутербродная пленка в протоколе на molbiol названа Saran Wrap, сейчас более известна под названием "стрейч". Мне она не нравится. Я с успехом использую бухгалтерские прозрачные файлики из канцтоварного магазина с ними на много удобнее. В темной комнате, но с красным светом, достаете 1 лист рентген пленки, кладете влажную мембрану на прозрачную пленку(можете использовать стекло вместо нижней пленки) капаете на мембрану субстрат и расплющиваете каплю субстрата по всей мембране прижимая к ней вторую верхнюю прозрачную пленку(смысл этой операции не дать субстрату контактировать с рентген пленкой, но в тоже время обеспечить попадание света от мембраны на пленку). Сверху на прозрачную пленку кладете рентген пленку и зажимаете весь этот бутерброд либо в медицинской кассете, в которой делают рентгеновские снимки, либо просто любым плоским грузом: книгой, стеклом, можно приклеить рентген пленку липкой лентой к верхней прозрачной пленке. Если вы делаете это в светонепроницаемой кассете, то можно включить обычное освещение и подождать. Если вы делаете это не в кассете и у вас слабый сигнал и нужна длительная экспозиция лучше накрыть весь бутерброд светонепроницаемой коробкой или одеялом. После экспозиции пленка извлекается и проявляется в так называемом рентгеновском проявителе, это можно делать при красном свете, потом пленка фиксируется в фото фиксаже, фиксаж может быть любой даже от цветного фотопроцесса. После фиксации пленку споласкивают в проточной водопроводной воде и сушат. Ссылки на проявители для рентген пленки. или Фиксажи: кристаллический гипосульфит натрия 250 гр. хлористый аммоний - 50 гр. метабисульфит натрия - 17 гр. Вода до 1л Тиосульфат 300г Хлористый аммоний 50г натрия сульфит 25г уксус столовый 9% - 60мл вода до 1 литра Уксус можно добавлять в раствор тиосульфата только после сульфита иначе будет беда. Проявители и фиксажи можно купить и готовые в специализированных конторах продающих реактивы для рентген кабинетов. Высушенную пленку можно сфотографировать со специального подсвеченного снизу просмотрового столика или с "белого" компьютерного монитора. Так же ее можно отсканировать на сканере, у которого есть модуль для транспарентного сканирования. |
Anastasia Buziashvili |
(Tom1 @ 05.06.2018 21:14) Не на фото пленку, а на рентгеновскую или купите специальную пленку для вестернов " голубой фильтр" называется, только после експозиции с мембраноиь пленку надо будет проявить сродни как обычную фотопленку проявляют- проявитель и закрепитель... посему по первоначалу рекомендую купить су бстрат для проявления пероксидазы прямо на мембране.... Tom1, спасибо большое! |
Tom1 Постоянный участник |
=========== Вспомнилось улица красных фонарей..... |
Anastasia Buziashvili |
(MMM @ 05.06.2018 23:03) --Темная комната у нас тоже есть. А красный фонарь? Надо приобрести рентген пленку исключительно медицинскую и максимально возможной чувствительности. Внимание! Пленка для дефектоскопии не подходит ни в коем случае. Пропись субстрата люминол/пара-кумаровая найдете в сети. Мембрану после инкубации ополоснуть в воде. Бутербродная пленка в протоколе на molbiol названа Saran Wrap, сейчас более известна под названием "стрейч". Мне она не нравится. Я с успехом использую бухгалтерские прозрачные файлики из канцтоварного магазина с ними на много удобнее. В темной комнате, но с красным светом, достаете 1 лист рентген пленки, кладете влажную мембрану на прозрачную пленку(можете использовать стекло вместо нижней пленки) капаете на мембрану субстрат и расплющиваете каплю субстрата по всей мембране прижимая к ней вторую верхнюю прозрачную пленку(смысл этой операции не дать субстрату контактировать с рентген пленкой, но в тоже время обеспечить попадание света от мембраны на пленку). Сверху на прозрачную пленку кладете рентген пленку и зажимаете весь этот бутерброд либо в медицинской кассете, в которой делают рентгеновские снимки, либо просто любым плоским грузом: книгой, стеклом, можно приклеить рентген пленку липкой лентой к верхней прозрачной пленке. Если вы делаете это в светонепроницаемой кассете, то можно включить обычное освещение и подождать. Если вы делаете это не в кассете и у вас слабый сигнал и нужна длительная экспозиция лучше накрыть весь бутерброд светонепроницаемой коробкой или одеялом. После экспозиции пленка извлекается и проявляется в так называемом рентгеновском проявителе, это можно делать при красном свете, потом пленка фиксируется в фото фиксаже, фиксаж может быть любой даже от цветного фотопроцесса. После фиксации пленку споласкивают в проточной водопроводной воде и сушат. Ссылки на проявители для рентген пленки. или Фиксажи: кристаллический гипосульфит натрия 250 гр. хлористый аммоний - 50 гр. метабисульфит натрия - 17 гр. Вода до 1л Тиосульфат 300г Хлористый аммоний 50г натрия сульфит 25г уксус столовый 9% - 60мл вода до 1 литра Уксус можно добавлять в раствор тиосульфата только после сульфита иначе будет беда. Проявители и фиксажи можно купить и готовые в специализированных конторах продающих реактивы для рентген кабинетов. Высушенную пленку можно сфотографировать со специального подсвеченного снизу просмотрового столика или с "белого" компьютерного монитора. Так же ее можно отсканировать на сканере, у которого есть модуль для транспарентного сканирования. МММ, спасибо огромное за очень подробную инструкцию!!! Значит, как я поняла, понадобятся: - высокочувствительная рентгеновская пленка. Аптечная подойдет? У нас такое вот, вроде, продается - файлы для документов (с этим проблем нет) - проявитель и фиксаж для рентгеновских снимков. Я пыталась самостоятельно разобраться с моим вопросом, искала готовые проявители-закрепители, нашла такое вот: - красная лампа. Вроде, у нас должна быть, но на случай, если нет, такая подойдет? - белая камера с подсветкой снизу. Такая у нас точно есть. И еще пару вопросов. Проявку-фиксацию пленки нужно проводить при красном свете, а сколько времени проявлять-фиксировать? После фиксации можно выносить пленку из темной комнаты, чтобы промыть в воде? Еще раз огромнейшее спасибо!!! |
MMM Постоянный участник |
--Проявку-фиксацию пленки нужно проводить при красном свете, а сколько времени проявлять-фиксировать? После фиксации можно выносить пленку из темной комнаты, чтобы промыть в воде? Проявку фиксацию можно и в полной темноте проводить, просто при красном свете - это гораздо удобнее. Для этого понадобятся 2 фотокюветы одна с проявителем и одна с фиксажом/закрепителем. Время проявки определяется визуально по потемнению пленки. В свежем проявителе это обычно 2-3 минуты, в сильно поюзаном проявителе - минут 5-7. Фиксаж обычно минуты 3-5 работает, если он быстрый. Но время фиксации можно прикинуть по времени просветления кусочка непроявленной пленки в фиксаже его надо умножить на 2 - это и будет нужное время фиксации. После фиксации в течении 30-40 секунд в свежем фиксаже пленку уже можно осветить обычным светом, однако фиксировать нужно полное необходимой время, хоть и при включенном свете. |
Anastasia Buziashvili |
|
watchesonline89 Постоянный участник |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |