Бетаин, ДМСО пробовали?

  
Гарантирую, что не будет димеров, но, однако, рекомендую 1 М бетаин в смеси.

  Магний убирать не могу, потому что у нас супермикс. И там его много, 4 мМ, что ли.

  Эти все мфолды и проч. - красивая теория. Вы возьмите любую случайную последовательность, она вам ещё не такие картинки нарисует.

При какой температуре свёрнуто? Как свернётся обратно, если нагреть до 95 и потом охладить до 60? Какие локальные дГ двуцепочечных участков? Сколько альтернативных локальных структур выдаёт мфолд (=происходит перестройка некоторых доменов)? Какова динамика отжига праймера и формирования локальной структуры? Как реагирует полимераза на двухцепочечные участки кДНК и как влияет на них её связывание?

Главное ведь пару первых ампликонов получить, а дальше дело пойдёт.

  Стоит задача сделать праймеры для реалтайма под последовательность около 300 бп, 80%ГЦ с кучей палиндромов. После нескольких неудачных попыток дизайна обычным путём (димеров избежать не удаётся) решил делать длинные праймеры с высокой Тм. И тут у меня несколько вопросов к специалистам. До какой длины и температуры отжига удлинять праймеры? Можно ли сделать праймер с Тм настолько высокой, что расплавятся все димеры (в разумных пределах конечно, например димеры, образованные двумя 6-нуклеотидными сайтами рестрикции). Критичны ли при таком подходе 3ь димеры? Как повлияет настолько высокая температура отжига на специфичность праймеров? Ну и практический момент - расплавится ли при 78С димер праймера содержащего ГГЦЦ?

  Странно, спрашивая, расплавятся ли димеры при 65, вы обзываете мфолд красивой теорией. Тут либо шашечки, либо ехать, термодинамика - она одна, пусть и методы расчетов разные

  Убрать магний хелатом тоже можно. Не конкретно с ЭДТА, но с одним "сикретным реагентом Х" я гонял ПЦРы даже в 20 мМ магнии, все работало.

  Это какой такой "сикретный хелат.реагент Х"? Неужели 5-кратный избыток dNTP