Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Nameless Постоянный участник CA |
Сообщение было отредактировано Nameless - 07.04.2010 20:46 |
RJ Dio Постоянный участник |
|
Nameless Постоянный участник CA |
Почему выше 72 задрать не удастся? Конкретное значение температуры отжига побоку, всё равно буду оптимизировать на диапазоне, мне главное чтобы все димеры расплавились. |
petr Постоянный участник |
|
afanasev-max Постоянный участник Irkutsk-Moscow-Irkutsk |
(petr @ 08.04.2010 00:34) и Hot-start |
Nameless Постоянный участник CA |
Про ДМСО думал, но теоретически он будет так же мешать и нормальному отжигу, что наверное скажется на эффективности. |
Esya Постоянный участник PA, USA |
|
Nameless Постоянный участник CA |
Дело не в длине а в Тм. |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
Если это возможно, выставите, пожалуйста, последовательность - попробуем коллективно. Как правило с такими GC-богатыми посл-ми программы тупят, поэтому - вручную. Если суждено образоваться димерам, то они неизбежны, к сожалению, и при максимальных Т отж.- исчезают вместе с ампликонами. Типа, горбатого не исправишь... В таких случаях основное правило - максимально обогатить AT нукл. 3-штрих половину праймеров. а еще лучше - 3-конец. При этом придется, конечно, жертвовать размерами ампликона. Но это мне кажется не столь принципиально... Сочетание 1М бетаина с 2-4% ДМСО может решить проблему, а эффективность при этом не пострадает.
|
afanasev-max Постоянный участник Irkutsk-Moscow-Irkutsk |
|
RJ Dio Постоянный участник |
|
Nameless Постоянный участник CA |
gccccatgccggccgcgcgctaggacccagcaggcgccgcgccgccgcagcccggggacagaggccgcctcggactctagggggcgacgcggcctgccgg gtataaaagctgggccggcgcgggccgggccattcgcgacccggaggtgcgcgggcgcgggcgagcagggtctccgggtgggcggcggcgacgccccgcg caggctggaggccgccgaggctcgccatgccgggagaactctaactcccccatggagtcggccgacttctacgaggcgg Пробовал: GGCGCGGGCGAGCAGGGTCT CGGCTCCGCCTCGTAGAAGTC не работают второй пары последовательности сейчас нет под рукой. Картинки: Untitled.jpg — (246.39к) 08.04.2010 — 22.04.2010 |
Yuri K IP-штамп: frbSxBL61s/9I гость |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
2. 5-gac tcc atg ggg gag tta gag ttct Размер продукта - больше 150, Т отж - не ниже 60. Гарантирую, что не будет димеров, но, однако, рекомендую 1 М бетаин в смеси.
|
Nameless Постоянный участник CA |
Протокол на циклере: 1х 95С - 3 мин 42х 95С - 20 сек диапазон 58-70С - 20 сек 72С - 20 сек 1х кривая плавления 58-95С, шаг 0.5С и 30 сек |
Nameless Постоянный участник CA |
(-Ъ- @ 08.04.2010 09:50) Думаете, при 65 расплавятся? Картинки: Untitled.jpg — (102.91к) 08.04.2010 — 22.04.2010 |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(Nameless @ 08.04.2010 20:06) скорее всего у вас 2х супемикс, поэтому 2 мМ Магний - норма. |
Yuri K IP-штамп: frbSxBL61s/9I гость |
Убрать магний хелатом тоже можно. Не конкретно с ЭДТА, но с одним "сикретным реагентом Х" я гонял ПЦРы даже в 20 мМ магнии, все работало.
|
Nameless Постоянный участник CA |
Сейчас ещё попробую парочку других, если не сработают, наверное буду покупать бетаин. |
avial Постоянный участник |
У вас же там не только в праймерах дело - у вас там шпилечных структур как в самой ДНК, так и в получающемся ампликоне штук 20 разных с довольно низкими dG (вплоть до -40, тогда как нормальные последовательности дают ну максимум -5, -10 или много коротких участков), причем они еще и протяженные в 20-30 пар - это ведь все расплавить надо, полимераза сама расплетать не будет. Во-первых, праймеры имеет смысл подбирать на участки, не формирующие стебель шпилек, даже если они будут неоптимальные на первый взгляд, во-вторых, либо тачдаун-ПЦР, либо бетаин, а лучше все вместе. Насчет первого пункта - в таких последовательностях иногда получаются нелогичные вещи, когда ужасные праймеры дают прекрасный продукт амплификации, а вроде бы хорошие по термодинамике, но чуть сбоку - еле видную полоску. |
avial Постоянный участник |
Вот куда здесь праймерам садиться? |
Nameless Постоянный участник CA |
При какой температуре свёрнуто? Как свернётся обратно, если нагреть до 95 и потом охладить до 60? Какие локальные dG двуцепочечных участков? Сколько альтернативных локальных структур выдаёт мфолд (=происходит перестройка некоторых доменов)? Какова динамика отжига праймера и формирования локальной структуры? Как реагирует полимераза на двухцепочечные участки кДНК и как влияет на них её связывание? Главное ведь пару первых ампликонов получить, а дальше дело пойдёт.
|
Nameless Постоянный участник CA |
- Не может , но ныряет ! А куда здесь садятся праймеры, которые у меня работают ? Сообщение было отредактировано Nameless - 09.04.2010 02:49 Картинки: Untitled.jpg — (60.15к) 08.04.2010 — 22.04.2010 |
avial Постоянный участник |
Кстати, как я уже написал, нормально амплифицирующиеся последовательности имеют короткие участки и не сильно большие dG, специально сейчас проверил 10 последних удачных пар. А вот и моя и ваша CG-богатая дает вот такую фигню со структурами. Дело ваше, верить или нет. Бетаин как раз все это плавит. Вернее, понижает температуру плавления и дает полимеразе нормально ползти. Переподбором тоже рано или поздно можно добиться результата, но бетаин дешевле. На порядки. А насчет полимеразы - подберите широкие праймеры в нормальном участке (200-300 пар отступите от вашего), они будут идеальны с точки зрения термодинамики, но ПЦР все равно нормально не пойдет. Не из-за праймеров, как можно догадаться. ЗЫ: На димеры самих праймеров смотреть бесполезно - они редко мешают, важны кросс-димеры и 3`-конец. Вот типичный пример: Праймер имеет димер в -12 dG, CG-состав 80%, но зато очень удачно лежит на последовательности, любой переподбор праймеров дает первую картинку (целевой амплификат отсутствует полностью), игры с условиями дают нормальный продукт. Практика здесь пассует полностью, красивая теория спасает. Картинки: 2.jpg — (19.64к) 08.04.2010 — 22.04.2010 1.jpg — (2.06к) 08.04.2010 — 22.04.2010 |
Nameless Постоянный участник CA |
Димеры на геле - один большой артефакт. При отжиге температура ведь одна, а внутри геля при форезе - другая . На форезе часто всё выглядит красиво и часто согласно теории, а вот если сделать кривую концентраций и глянуть на кривую плавления... Отступать не могу, нужно именно к этому участку (CHIP). |
avial Постоянный участник |
Впрочем, иногда от димеров не помогает ничего |
Guest IP-штамп: frgsE2/VcFQ2Y гость |
(Nameless @ 09.04.2010 01:06) Эти все мфолды и проч. - красивая теория. Вы возьмите любую случайную последовательность, она вам ещё не такие картинки нарисует. При какой температуре свёрнуто? Как свернётся обратно, если нагреть до 95 и потом охладить до 60? Какие локальные дГ двуцепочечных участков? Сколько альтернативных локальных структур выдаёт мфолд (=происходит перестройка некоторых доменов)? Какова динамика отжига праймера и формирования локальной структуры? Как реагирует полимераза на двухцепочечные участки кДНК и как влияет на них её связывание? Главное ведь пару первых ампликонов получить, а дальше дело пойдёт. будет зависеть от "скорости охладить" на современных циклерах от 95 до 60 за 3 секунды -пофиг , на "тракторах" от 95 до 60 за сто лет - шпилька сxлопнется |
Guest IP-штамп: frgsE2/VcFQ2Y гость |
(Nameless @ 07.04.2010 20:34) Стоит задача сделать праймеры для реалтайма под последовательность около 300 бп, 80%ГЦ с кучей палиндромов. После нескольких неудачных попыток дизайна обычным путём (димеров избежать не удаётся) решил делать длинные праймеры с высокой Тм. И тут у меня несколько вопросов к специалистам. До какой длины и температуры отжига удлинять праймеры? Можно ли сделать праймер с Тм настолько высокой, что расплавятся все димеры (в разумных пределах конечно, например димеры, образованные двумя 6-нуклеотидными сайтами рестрикции). Критичны ли при таком подходе 3ь димеры? Как повлияет настолько высокая температура отжига на специфичность праймеров? Ну и практический момент - расплавится ли при 78С димер праймера содержащего ГГЦЦ? у вас кинетикодинамикой вторичных структур однонитевых ДНК - мозговой понос |
Nameless Постоянный участник CA |
(avial @ 09.04.2010 15:17) Странно, спрашивая, расплавятся ли димеры при 65, вы обзываете мфолд красивой теорией. Тут либо шашечки, либо ехать, термодинамика - она одна, пусть и методы расчетов разные Красивой теорией я считаю сворачивание в мфолд последовательностей в несколько сотен нуклеотидов. Ехать для меня - это кривая плавления. Если димеров нет на ней при 65, значит они плавятся. |
avial Постоянный участник |
Речь о конкуренции - что окажется выгоднее при ПЦР - сворачивание шпильки или отжиг праймера. Зависит от кучи параметров, в том числе, как здесь правильно заметили, от характеристик циклера. И называть мфолд красивой теорией, по которой, между прочим, весь цивилизованный мир считает те же скорпионы, которые потом работают, - несколько странно.
|
yamiren Участник |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(Yuri K @ 08.04.2010 20:37) Убрать магний хелатом тоже можно. Не конкретно с ЭДТА, но с одним "сикретным реагентом Х" я гонял ПЦРы даже в 20 мМ магнии, все работало. Это какой такой "сикретный хелат.реагент Х"? Неужели 5-кратный избыток dNTP |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
При использовании современных быстрых и сверхбыстрых циклеров теория остается только классикой - другая кинетика. |
бутанол Постоянный участник Новосибирск |
|
Yuri K IP-штамп: frbSxBL61s/9I гость |
(-Ъ- @ 12.04.2010 10:00) Не, стандартная СуперМикс 2х от ИВГНа, только магния добавлял. |
Shadow Постоянный участник Минск |
|
avial Постоянный участник |
|
nigoal123 IP-штамп: fr/1ZkUsuBQOE гость |
It influences some readers. |
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |