 * |   |
|
Molbiol.ru | Project | Protocols | Programs | Literature Web | Companies | Marketplace | Labor exchange Today's active topics [ Log In* | Register* ] Forum: |
|
Rules
* Определение концентрации белка (Брэдфорд; Лоури) -- deleted by avor --
Topic related to: Методы Мерион Брэдфорд и Лоури
Options: I want to be curator* · Track this topic* · Email this topic · Print this topic*
Topic view:* Outline · [ Standard ] · Linear+
   |
 Forum robotAdvanced Member на сервере в Москве  |
 09.11.2005 18:45
Определение концентрации белка. Методы Брэдфорда и Лоури. Раздел Методы сайта molbiol.ru. |
|
Guest IP-stamp: frNVjPT6S76SU guest |
09.11.2005 18:45
Хм, кумасси синеет и при растворении в спирту. Для растворения нужно использовать спирт 95%. Затем добавляем заводскую о-фосфорную кислоту (85%) раствор становится коричневым. После доведения до объёма бидистил. водой коричневый раствор вновь приобретает синеватый оттенок. По прошествии 5-7 дней раствор снова становиться коричневым. Есть предположение что у каждого своя Бредфорд:) |
|
0xy Member |
10.11.2005 12:49
|
|
_vectors_ IP-stamp: frftLGqhpFF.A guest |
11.01.2006 02:55
|
|
Guest IP-stamp: frYTsygo7W/Kk guest |
21.03.2006 16:41
|
|
bukach Advanced Member Geneva, Switzerland |
21.03.2006 17:48
2. купить. главное с R не перепутать This post has been edited by bukach: 21.03.2006 18:02 |
|
melkij becc Advanced Member |
21.03.2006 18:08
(Гость @ 09.11.2005 18:45)  Некоторые наблюдения за раствором...Хм, кумасси синеет и при растворении в спирту. Для растворения нужно использовать спирт 95%. Затем добавляем заводскую о-фосфорную кислоту (85%) раствор становится коричневым. После доведения до объёма бидистил. водой коричневый раствор вновь приобретает синеватый оттенок. По прошествии 5-7 дней раствор снова становиться коричневым. Есть предположение что у каждого своя Бредфорд:) странно себя ведет кумасся. она простояла достаточное время, неоднократно использовалась для анализа. а тут бац, стала синеть. отливаешь ее в стаканчик сколь надо. еще ничего не добавлял. глядь, она уже не совсем коричневая, что-то синее проклевывается. Ну и как с такой работать? |
|
bukach Advanced Member Geneva, Switzerland |
21.03.2006 18:23
2. кислоты докапать до покричневения (не знаю что получится, но можно попробовать). 3. в след раз делать меньше чтоб долго не хранить |
|
Guest IP-stamp: frswkCVHxyt0w guest |
26.03.2006 16:22
|
|
Guest IP-stamp: frswkCVHxyt0w guest |
26.03.2006 19:45
|
|
bukach Advanced Member Geneva, Switzerland |
27.03.2006 15:29
(Гость @ 26.03.2006 16:22) Это модификация метода Лоури? В стандартной методике указан тартрат натрия или калия, которого у меня нет. Его действительно можно заменить цитратом?тартрат нужен для того, чтобы медь в щелочной среде в осадок не выпала. думается, что цитратом заменить его можно. например, в биуретовом реактиве - тартрат, а в реактиве Бенедикта (микробиуретовый метод) - цитрат. (Гость) А вы ничего не пропустили? Концентрация карбоната натрия в реагенте А не должна составлять 20 %, как в оригинальной методике Лоури ? Дайте, пожалуйста, ссылку на какую-нибудь статью с этим методом.в оригинальной методике Лоури тоже 2%. можете сами убедиться - статья в открытом доступе http://www.jbc.org/cgi/reprint/193/1/265 |
|
bukach Advanced Member Geneva, Switzerland |
27.03.2006 15:35
(с ссылками и модификациями) Attached File(s)
|
|
Guest IP-stamp: frYiE1fhcbUzM guest |
07.05.2006 18:06
|
|
bukach Advanced Member Geneva, Switzerland |
10.05.2006 14:55
(Гость @ 07.05.2006 19:06) реактив Бредфорд используется сразу после пригоовления или должен стоять какое то время?вполне можно. перед употреблением отфильтровать его желательно. еще стоит учесть, что со временем калибровка может измениться, посему лучшее её каждый раз повторять. |
|
Guest IP-stamp: frWKf2AKRVu2Q guest |
19.07.2006 07:05
|
|
stanislaff |
19.07.2006 10:23
|
|
guest: yMHuK IP-stamp: frydUUByF2C9E guest |
21.07.2006 18:21
(Гость @ 19.07.2006 07:05) Никто не в курсе в чем заключается принцип окрашивания в обоих методах и от чего оно зависит. А то есть белочек у меня который красится по Лоури, а по Брэдфорд не хочет и из-за этого я на форезе его не вижу, хотя на 280нм дает интенсивный пик при гел-фильтрацииCoomassie (Bradford) красит избранные аминокислоты, потому результат зависит не только от концентрации, но и от аминокислотного состава. Соответственно, для точной концентрации калибровать нужно или по тому же самому белку, или вводить поправку, если она для Вашего белка известна. У Lowry вариации между белками с разным составом раза в 2.5 меньше. Выбор между этими двумя обычно определяется совместимостью с детергентами, солями, растворителями, редуцирующими агентами и прочей дрянью в белковом растворе. |
|
guest: ммм IP-stamp: frwHRv5zEzGDY guest |
21.07.2006 18:51
Гы! все еще проще, вообщем кумася красит в основном лизины и аргинины и немного пептидную связь. А Лоури больше похож на БСА, хотя это у меня только щас мызль такая прорезалась, раньше я все грешил на тирозины, он неравнодушен к тирозину ибо по жизни реагент фолина используется для обнаружения фенолов. |
|
Mac-1 Advanced Member оттуда |
22.07.2006 08:15
(stanislaff @ 19.07.2006 03:23) Есть еще один нюанс. Брэдфорд очень чувствителен к ацетату и формиату натрия. Я буквально только что делал анализ - по Брэдфорду концентрация протеина аж зашкаливает, а на электрофорезе - полный ноль. Приготовил растворы ацетата и формиата натрия - снова зашкаливает (рН 7-9). Гидроксид и хлорид натрия окрашивания не дают, уксусная кислота - тоже. Грешу на ацетат- и формиат-анионы...Синяя как раз анионная форма Кумасси. А вы не пробовали добавлять в ваш образец с ацетатом и/или формиатом равный обьем (или больше) 1М NaOH? Посмотрите об этом статью Стошека (Stoscheck) в 182 томе Methods in Enzymology, там где-то в самом начале (нет под рукой сейчас). (guest: ммм @ 21.07.2006 11:51) Coomassie (Bradford) красит избранные аминокислоты, потому результат зависит не только от концентрации, но и от аминокислотного состава.Гы! все еще проще, вообщем кумася красит в основном лизины и аргинины и немного пептидную связь. А Лоури больше похож на БСА, хотя это у меня только щас мызль такая прорезалась, раньше я все грешил на тирозины, он неравнодушен к тирозину ибо по жизни реагент фолина используется для обнаружения фенолов. Вообще-то, и Бредфорд тоже отчасти неравнодушен к тирозину.  При Бредфорде Кумасся в связывается в основном с аргинином и в гораздо меньшей степени (примерно в 8 раз меньше) с лизином, а также с ароматическими АК: триптофаном, тирозином, фенилаланином и гистидином (гидрофобные взаимодействия). Так что и здесь триптофан фигурирует. ---------------------------------------------- Есть еще такой старинный и забытый сейчас метод: проба с ТХУ. В образец добавляют ТХУ до 10%, вортексируют и меряют мутность раствора, например при 320-340 нм. Калибровочную кривую можно составить по абсолютно любому белку. Метод грубый, не очень точный и не очень чувствительный, но зато он очень прост, нет вариации по белкам, и он совершенно равнодушный к многим добавкам и примесям в буфере и работает там, где и Лоури, и Бредфорд не фурычат. Особо полезен для белковых смесей, на ранних этапах очистки, когда белка много, а калибровки по индивидуальным белкам - ненадежны. |
|
Vladimir70 Advanced Member |
22.07.2006 18:37
Правда-правда. У меня тут интересный случаи тоже есть, ИЛ15 и ИФН-бета. Если по тагу считать то ИЛ15 в два раза больше, а на геле, кумасси раза в три интенсивнеее Интерферон красит. Пирсовскии BCA кит согласен с тагом. Прикольно. Вот и верь после этого людям. |
|
guest: yMHuK IP-stamp: frydUUByF2C9E guest |
24.07.2006 19:45
(Vladimir70 @ 22.07.2006 18:37) Правда-правда. У меня тут интересный случаи тоже есть, ИЛ15 и ИФН-бета. Если по тагу считать то ИЛ15 в два раза больше, а на геле, кумасси раза в три интенсивнеее Интерферон красит. Пирсовскии BCA кит согласен с тагом. Прикольно.Вот и верь после этого людям. А всё потому, что и BCA, и Lowry основаны на биуретовой реакции - восстановлении меди в щелочной среде. Для этого достаточно пептидных связей, всякую неразбериху вносят некоторые боковые цепи. И коэффициент вариации для разных беллков у BCA и Lowry весьма похож, и, как я уже писал, заметно ниже Брэдфорда. |
|
Guest IP-stamp: frGRE0t1TybUY guest |
12.09.2006 17:18
|
|
Афанасий IP-stamp: fre6q1hHiDSAM guest |
09.12.2006 19:57
200 мл фосфорной кислоты 100 мл этанола Это сток. Последний раз готовил года два назад. Работаает как зайка по сей день и не синеет. Я так понимаю, что это практически вечно. 30 мл стока 80 мл фосфорной кислоты 100 мл этанола вода до 600 мл (рабочий) проба:краситель=1:1,5 очень удобно ставить в плашках (100+150 мкл) |
|
guest: ммм IP-stamp: frHvyGooYAnV2 guest |
11.12.2006 16:03
Нет!!!! |
|
Guest IP-stamp: frGqyYT8IU7LU guest |
01.03.2007 17:06
|
|
Guest IP-stamp: frGqyYT8IU7LU guest |
01.03.2007 17:23
Фильтровать нужно 2 раза по такой схеме (желательно иметь мембранный фильтр больше, чем 0.22, а можно и через фильтровальную бумагу в несколько слоев, в зависимости от объема - 1 слой на 200 мл): 1 раз через 15-18 часов после приготовления, второй раз - через сутки. И после этого уже настаивать 7-10 дней в зависимости от температуры. И контролировать динамику на спектрофотометре. |
|
BDS Иркутск |
01.03.2007 17:46
Сталкивался ли кто-нибудь с подобным, с чем это может быть связано, и как нам выровнять белок, чтобы полученные после Вестерн Блоттинга результаты были достоверны. Заранее спасибо. |
|
guest: ммм IP-stamp: frwHRv5zEzGDY guest |
01.03.2007 19:52
Но то что описываете вы больше всего похоже на плохую окраску геля кумасси, у вас было плохое пермешивание или плохо гель в ваночке болтался, но я бы аккуратно перекрасил бы гель для начала. В принципе белок можно выровнять прямо по гелю. Либо на глаз, либо взять скан геля обсчитать его с помощью какой нибудь проги. Еще мложно опробовать другие методы: BCA и Брэдфорд. А еще есть чудная хрень: кумася на фильтровашке хороша тем что белок сорбируентся на бумаге а потом отмывется от всех модулирующих примесей. |
|
Лидия Боровкова |
02.03.2007 12:14
|
|
Guest IP-stamp: frHWt7eplAB5c guest |
19.03.2007 16:19
|
|
bukach Advanced Member Geneva, Switzerland |
20.03.2007 00:10
(Гость @ 19.03.2007 16:19) Народ, напомните, пожалуйста, относительно чего проводят калибровку: относительно того в чем растворен белок или относительно вода+Кумасси (без белка)?вы, наверное, имеете ввиду нулевую точку на калибровке? лучше то, в чём растворён белок. |
|
Афанасий IP-stamp: frFrHZMiJqwK2 guest |
26.03.2007 19:13
В целом, чувствительность плавает от соотношения белок/краска. Больше Кумасси - меньше белка засекает. Вот и все соображения. |
|
Лидия Боровкова |
27.03.2007 09:44
(Афанасий @ 26.03.2007 19:13) 2 Лидия БоровкинаВ целом, чувствительность плавает от соотношения белок/краска. Больше Кумасси - меньше белка засекает. Вот и все соображения. |
|
Лидия Боровкова |
27.03.2007 09:49
|
|
Guest IP-stamp: frHWt7eplAB5c guest |
04.05.2007 09:53
|
|
Guest IP-stamp: fr4MbcymAiCcU guest |
25.07.2007 12:24
|
|
guest: ммм IP-stamp: frwHRv5zEzGDY guest |
25.07.2007 12:59
Если чиста желтый, то либа кумаси был не кумаси, а например БФС. Либо спирт не спирт Либо кислота не кислота. |
|
Яра Оболенск |
20.08.2007 22:35
(Афанасий @ 26.03.2007 20:13) В целом, чувствительность плавает от соотношения белок/краска. Больше Кумасси - меньше белка засекает. Вот и все соображения. Совсем недавно валидировала методику Бредфод для нашей лабы. Как ни странно - больше кумасси засекает больше белка. В моем случае удвоение концентрации красителя и смена этанола на метанол позволила стабильно определять белок в количестве 1.5 мкг\мл, т.е. чувствительность метода повысилась примерно на порядок. |
|
guest: Olga IP-stamp: frGqyYT8IU7LU guest |
04.09.2007 15:35
Для снятия белка с колонки хочу использовать детергент SDS 0,1 - 0,5%. По Бредфорду SDS сам интенсивно окрашивается (р-р Бредфорда готовый покупной), невозможно построить калибровку, что уже говорить о белке. Пыталась сделать калибровку при А280, меньше 30-40 мкг/мл не улавливается, а нужно определять концентрацию от 1 мкг/мл. А еще ерунда получается, когда одно и то же известное количество БСА, растворенное в дистилляте, измеряю при А280 получаю одну концентрацию, а по Бредфорду выходит другая (к исходной концентрации ближе первый метод). Возможно Бредфорд используют для малых концентраций, но хочется ведь проверить, чего я там насчитала. Метод Лоури никогда не пробовала и не знаю как отреагирует SDS. Заранее, спасибо! |
|
guest: ммм IP-stamp: frwHRv5zEzGDY guest |
05.09.2007 15:40
среднее на круг поглощение белка на 280нм А=1 при 1мг/мл так что ниче удивительного. --По Бредфорду SDS сам интенсивно окрашивается (р-р Бредфорда готовый покупной), невозможно построить калибровку, что уже говорить о белке. Известный фахт. -- А еще ерунда получается, когда одно и то же известное количество БСА, растворенное в дистилляте, измеряю при А280 получаю одну концентрацию, а по Бредфорду выходит другая (к исходной концентрации ближе первый метод). А совпадение концентраций зависит от того по какому белку вы калибровали Брэдфорд. Если по БСА, то должен совпадать в пределах ашипки. --Возможно Бредфорд используют для малых концентраций, но хочется ведь проверить, чего я там насчитала. Кривая брэдфорд обычно теряет линейность в районе 8-15 мкг белка на мл раствора Брэдфорд, при длине оптического пути 1см. ---Метод Лоури никогда не пробовала и не знаю как отреагирует SDS. Вроде никак. Есть еще крутой метод BCA(буквы латинские) от Pirce он чувствительнее Лоури и чуть чувствительнее(не намного) Брэдфорд, но нечувствителен к SDS. Зато Лоури и BCA чувствительны к хелаторам Типа ЭДТА, Цитрат, Роданид(изотиоцианат), И к востановителям типа фенол, ДТТ, бета-МЭ. Лоури еще чувствителен к тритону. |
|
guest: ммм IP-stamp: frwHRv5zEzGDY guest |
05.09.2007 15:44
А развести стандартный раствор до более низких концентраций, вам вера не позволяет. |
|
Guest IP-stamp: fr7BTdNn2Vl0M guest |
07.09.2007 09:13
Хочу посмотреть содержание белка (то бишь и не белок вовсе, как я понимаю, а скорее уже полипептиды и маленькие пептиды) в мясных гидролизатах. Какой метод лучше использовать: Лоури или Брэдфорд или что-то уж совсем другое? Насколько я знаю, Лоури определяет только пептиды не меньше 3-х аминокислот, а мне бы по максимуму определить... |
|
guest: ммм IP-stamp: frwHRv5zEzGDY guest |
07.09.2007 13:29
Насколько я знаю, Лоури определяет только пептиды не меньше 3-х аминокислот, а мне бы по максимуму определить... Нингидрин. |
|
guest: SOTO IP-stamp: frBt9Uk92YanU guest |
02.10.2007 15:11
 Не могу сделать колибровку по Бредфорд для 2-50мкг/мл белка(BSA). Краситель доисторический - возможно нада перекристализировать или покупать новый... Спектры, как на меня, неудовлетворительные. Если не в лом то вышлите мне спектр раабочево раствора без белка для сравнения... brykovvasja@gala.net |
|
bukach Advanced Member Geneva, Switzerland |
02.10.2007 23:24
(guest: SOTO @ 02.10.2007 16:11) Не могу сделать колибровку по Бредфорд для 2-50мкг/мл белка(BSA). Краситель доисторический - возможно нада перекристализировать или покупать новый... Спектры, как на меня, неудовлетворительные. Если не в лом то вышлите мне спектр раабочево раствора без белка для сравнения... brykovvasja@gala.net для микроопределения (100 мкл белка + 1 мл раствора кумасси) чувствительность 1-10 мкг (т.е. 10-100 мкг/мл). это раз. дело может быть не в самом кумасси, а в фосфорной кислоте. это два. если краска синеватая, а не коричневая, то и без спектров понятно, что неправильная. и что значит "не могу сделать"? да, и БСА для Бредфорд лучше не использовать. |
|
guest: SOTO IP-stamp: fryv0erhfwKjk guest |
05.10.2007 15:19
|
|
guest: ммм IP-stamp: frwHRv5zEzGDY guest |
08.10.2007 13:27
Либо остановитесь на 35 мкг, либо бухните мл 5-10 фосфорной в ваш Брэдфорд, только потом не жалуйтесь, что у вас чувствительность упала. |
|
guest: Soto IP-stamp: frG/ehwVgdnf. guest |
11.10.2007 19:17
|
|
guest: ммм IP-stamp: frwHRv5zEzGDY guest |
11.10.2007 19:38
я не снимал эти спектры, но по моему мнению они должны иметь форму размытого(возможно сильно) пика, а плато это скорее вопрос к прибору чем к спектру. --Есть подозрение, что краситель не достаточно очищен или просто цже негодный для использования... Товарисчь у вас есть градуировачная кривая, да она не идеальна, дело возможно в красителе, но скорее всего нет, ибо если краситель грязный, то у вас скорее всего вообще ничего не получится даже раствор нормальный не приготовите. -- И как влияет степень читоты фосфорной кислоты на процес прохождения реакции между красителем и белком? Давайте без обяснений механизмов, а только эмпирику. Кислота способствует образованию коричневой формы красителя, чем ее больше тем тяжелее белку связать краситель в синий цвет. Если кислоты мало то исходный краситель имеет сильную синезеленую опалесценцию. А градуировчная кривая очень крутая с коротким линейным отрезком и быстро выходит на плато. Если кислоты много то раствор сильно коричневый и не имеет осинезеленой опалесценции, а градуировачная кривая пологая и сохраняет линейность до довольно высокой концентрации белка, но зато снижается ее чувствительность вплоть до полного отсутствия. Известно что фосфорная кислота склонна всасывать в себя воду, кроме того фосфорная кислота может иметь разную концентрацию и в товарном виде, пропись же раствора Брэдфорд написана для 85% кислоты, если в исходном растворе концентрация кислоты отличается от это цифры, возможны траблы. И еще одно замечание по поводу: --0.5 мл раствор белка + 2.5 мл красителя Очень большое разведение исходного раствора Брэдфорд, а следовательно и снижение концентрации кислоты. Обычно вносят 1/20 -1/10 от раствора Брэдфорд. |
|
Guest IP-stamp: frW0uqO/N5.7k guest |
19.10.2007 13:24
Считать кол-во аргининов и лизинов в калибровочном белке и опытном? В моём белке например аргининов всего 6. И если считать так, то его концентрация просто офигеть. Судя по форезу, это совсем не так. И кстати, какие именно остатки красит R-250? |
| « Next Oldest · Molecular and cellular biology · Next Newest » |
 |
· Викимарт - все интернет-магазины в одном месте · Доска объявлений Board.com.ua ·
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---
Helicon · Dia-m · InterLabService · Beckman Coulter · SkyGen · OPTEC · BIOCAD · Evrogen · Syntol · Bioline · Sartorius · Khimexpert · SibEnzyme · Tecan · Danies · NPP «TRIS» · Bialexa · FizLabPribor · Genotek · ATG Service Gene · Biogen-Analitika
Your forum · editor@zbio.net · Time is now: 19.04.24 03:16
Powered by Invision Power Board(Trial) v2.0.0 © 2024 IPS, Inc.