Здравствуйте друзья,



2. Один и тот же образец при повторных проведениях Вестерна показывает различной интенсивности линию на мембранах.

Спасибо

  Вестерн блот - не количественный метод, так что у это нормально.

Если хотите посчитать чтото - то делать надо три повтора и считать среднее, но и это не гарантирует точности.

  Сравнивать можно только в одном геле. В разных гелях можно пытаться сравнивать после нормирования по стандарту.

Изменения интенсивности окраски могут быть из-за:
1)Изменений условий переноса(Время, токи/напряжения, расстояния между электродами, изменения состава буфера, разная температура.)
2)Изменения в условиях инкубации с антителами, время инкубации, температура инкубации, разведения антител, возможные повторные использования. Так же возможны разные результаты из -за изменения рН используемых растворов и тд.
3)Изменения в субстратах они могут попросту сдыхать при хранении, хотя это редкость и если все остальное хорошо, то можно просто заметить постепенной ухудшение сигнала со временем.

  А я извиняюсь за дурацкий вопрос. Вот вы пишете на пробах стандарта концентрацию в микрограммах на мл. А сколько вы на форез наносите 1мкл 5,10, 25. И красите вы ECL(хемилюминесценция) или какая  другая окраска. И если это хемилюминесценция то какая экспозиция у ваших картинок(какое время накапливался сигнал?)

  Ну, эта, у вас дикий перегруз прядка эдак на 3 - 5.

  Усего и штандарту и проб. Разводить как минимум в тысячу раз и на люминесценции держать минут так 5-15.

  --полосы становятся слабо видны.
Это от того что вы их экспонируете мало.  Вы делаете дикую перегрузку потом дико коротко экспонируете сигнал естественно низкие концентрации вы не увидите.

Представьте что вы светите на фотоаппарат прожектором или солнцем, что бы вам не засветить пленку в выжжженный свет вы делаете соответствующую маленькую экспозицию, но при такой экспозиции обычные, нормально освещенные предметы оказываются практически как-будто в кромешной тьме их будет просто не видно.

  я же не могу экспонировать одни полосы дольше, а другие - быстрее...