 * |   |
|
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда |  Zbio-wikiNG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: |
|
Правила
* Как стабилизировать вирусную РНК в плазме
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.
   |
 Azato2000Постоянный участник  |
 13.03.2014 13:25
Соотношение: 2/3 RNAlater и 1/3 плазмы. Заявленный результат - РНК при 37С не разрушалась в течение месяца . Решил сделать контрольные образцы плазмы с помощью этого стабилизатора. В результате получилась белая жижа. Мне казалось это из-за того, что плазма изначально была с хилезом. Но почитал инструкцию Ambion и оказалось, что они вообще не рекомендуют использовать RNAlater для плазмы или сыворотки из-за того, что там много белка, который сворачивается и иммобилизует РНК. А вот Qiagen про это молчит. Меня вообще-то сама потеря некоторой доли РНК не сильно волнует, главное чтобы оставшаяся часть была стабильна в течение 1 года Есть ли какие-нибудь идеи? Сообщение было отредактировано Azato2000 - 13.03.2014 13:27 |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
13.03.2014 13:40
 ), а из-за того, что сульфат аммония в RNAlater разбавляется выше критической величины. Жижа тут не причем, пусть себе образуется и это даже хорошо. Для инактивации нуклеаз важна высокая концентрация соли. Назначение RNAlater - ткани, в первую очередь, а там белка еще выше.
|
|
Azato2000 Постоянный участник |
13.03.2014 13:51
(-Ъ- @ 13.03.2014 16:40)  Плазма или сыворотка не рекомендуется не из-за того, что там "много белка" (особенно в сыворотке ), а из-за того, что сульфат аммония в RNAlater разбавляется выше критической величины. Жижа тут не причем, пусть себе образуется и это даже хорошо. Для инактивации нуклеаз важна высокая концентрация соли. Назначение RNAlater - ткани, в первую очередь, а там белка еще выше.Спасибо. А какое разбавление RNAlater не будет критическим? 4/5? |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
13.03.2014 13:59
(Azato2000 @ 13.03.2014 14:51) Спасибо. А какое разбавление RNAlater не будет критическим? 4/5?Если про это не говорится в инструкции - значит надо заглядывать в патент. Я давно, 2 или 3 года назад выкладывал на эту тему ссылку. Попробую найти В принципе можно вычислить из рекомендуемого соотношения "массы ткани к объему RNAlater".
|
|
Azato2000 Постоянный участник |
13.03.2014 14:14
(-Ъ- @ 13.03.2014 16:59) Я давно, 2 или 3 года назад выкладывал на эту тему ссылку. Попробую найти Буду очень благодарен 
|
|
Azato2000 Постоянный участник |
13.03.2014 15:01
25 mM Sodium Citrate, 10 mM EDTA, 70 g ammonium sulfate/100 ml solution, pH 5.2. При этом пишется, что даже при 10 гр на 100 мл при рН 5,5 эффект сохраняется. А у меня при в соотношении 2/3 получится ~47гр на 100 мл. Не знаю насколько сильно забуферен RNAlater и какой будет сдвиг рН. Прихожу к тому мнению, что все делаю правильно. Буду использовать RNAlater и замораживать при минус 20 потому как минус 70 нет 
|
|
avial Постоянный участник |
13.03.2014 15:21
|
|
guest: ммм IP-штамп: frQlBxj4iQSg. гость |
13.03.2014 16:03
|
|
Azato2000 Постоянный участник |
13.03.2014 16:11
(guest: ммм @ 13.03.2014 19:03) Если это голая РНК я бы не рискнул для ее последующего количественного измерения использовать РНКлейтер. А вот если это подразумевается РНК в составе вирулентных вирусов, то в данном случае даже заморозка на -80 будет эффективна.Нет морозилки на -80. Это КДЛ. |
|
guest: ммм IP-штамп: frQlBxj4iQSg. гость |
13.03.2014 16:49
Если вы собираетесь хранить материал годами вам ничего не поможет кроме жидкого азота если вам на недельку и только вирусные частицы, то скорее всего и на -20 пролежит. Легко проверить разок и не парить себе и снабженцам мозг. |
|
ASDF Постоянный участник |
14.03.2014 10:58
Если делать из сыворотки, то лучше брать нативную отрицательную сыворотку и туда перед выделением добавлять оттитрованную РНК, которая разаликвочена и хранится в РНК-латере на -20.
|
|
Azato2000 Постоянный участник |
14.03.2014 11:44
(ASDF @ 14.03.2014 13:58) Такие контроли делают из армированной РНК. Или упаковкой в фаг MS2 или синтетические модифицированные РНК-олиги нужного размера под ампликон.Если делать из сыворотки, то лучше брать нативную отрицательную сыворотку и туда перед выделением добавлять оттитрованную РНК, которая разаликвочена и хранится в РНК-латере на -20. олиги отпадают сразу ибо не знаю последовательность ампликона (типа коммерческая тайна) А вообще мне нравится предложенный вами подход. Единственный минус - возникает дополнительный источник погрешностей при добавлении РНК в отрицательную сыворотку. Спасибо! |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
14.03.2014 12:20
Армированная РНК это и есть клорированная в МС-2. Это выход из ситуации, как и делают некоторые разработчики РНК-вых китов. Транскрипты в присутствии избытка Ингибитора РНК-аз и ДТТ лежат в холодильнике +4 без проблем очень долго, и лейтер не нужен. Лейтер хорош для хранения нативных тканей. Перед добавлением в сыворотку транскрипта, следует добавить лизирующий раствор на основе 4-5 М ГТЦ... синтез "олиги отпадают сразу ибо не знаю последовательность ампликона (типа коммерческая тайна)" - это Вы про HCV & HIV ? |
|
Azato2000 Постоянный участник |
14.03.2014 12:34
(-Ъ- @ 14.03.2014 15:20) синтез "олиги отпадают сразу ибо не знаю последовательность ампликона (типа коммерческая тайна)" - это Вы про HCV & HIV ? Я так полагаю у вас есть чем меня порадовать? Да ВГС и ВИЧ
|
|
Panaev Постоянный участник |
14.03.2014 12:59
|
|
Azato2000 Постоянный участник |
14.03.2014 13:23
(Panaev @ 14.03.2014 15:59) Может сублимировать проще? Где-нибудь напроситься.даже если напроситься. проект-то международный. пересылка биоматериала за границу, нетушки. Мне этот гемор на фиг не сдался. Будем исходить из возможностей клинической лаборатории. Морозилки на -20 и стабилизатор. |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
14.03.2014 13:33
(Panaev @ 14.03.2014 13:59) Может сублимировать проще? Где-нибудь напроситься.Тоже выход, может быть даже самый лучшей метод, которым я лично злоупотребляю. Олиги для HIV как правило размером около 150 нт, а для HCV - 250. А Рош с Абботом их не держит за семью печатями, точно знаю  .
|
|
watchesbiz Постоянный участник |
 03.12.2021 19:17
|
|
watchesonline89 Постоянный участник |
28.12.2022 10:54
|
| « Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |
 |
· Викимарт - все интернет-магазины в одном месте · Доска объявлений Board.com.ua ·
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---
Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Powered by Invision Power Board(Trial) v2.0.0 © 2024 IPS, Inc.