molbiol.ru -> Большой разброс пороговых циклов ПЦР-РВ

> Все форумы > Тематические форумы > Молекулярная и клеточная биология

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ

Правила FAQ* Поиск* Участники* Календарь* Избранные темы* Форум Форумов*

Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ]

Форум:

* Большой разброс пороговых циклов ПЦР-РВ

Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.

Nucleoid

20.11.2018 10:39

URL #1

Добрый день коллеги, нужна помощь по двум вопросам. Было исследовано 3 образца на несколько мутаций. В данном случае речь пойдёт о мутации JAK2V617F, которая отображена на картинках, она поставлена в двух повторностях. В образце под номером 4945 разница между выходами кривых флуоресценции довольно весомая, около 0.8 (должно быть не более 0.5), хотя все смеси готовились в одно время, в одних и тех же условиях. Использовалась Taq-полимераза с TaqMan зондами. Что может быть причиной такой разницы? И второй вопрос касается максимумов кривых. В случае со второй повторностью максимумы заметно ниже по сравнению с первой во всех исследуемых пробах. Что могло повлиять на снижение уровня флуоресценции во второй повторности? Напомню, что приготовление смесей и постановка проводились в одно и то же время в одних и тех же условиях. Заранее благодарю за ответы.

Картинки:
картинка: 4943.PNG

4943.PNG — (51.72к)

картинка: 4944.PNG

4944.PNG — (50.87к)

картинка: 4945.PNG

4945.PNG — (51.14к)

semi
Постоянный участник
Москва

20.11.2018 14:21

URL #2

Это же у вас в одном ряду случилось?
Может быть, что-то с пробирками: слегка испарились из-за плохо заклеенных-закрытых крышек или запачкались как-то.

Кривые жалостливые, конечно. Что-то реакцию душит, IMHO.

Horse-radish
Участник

20.11.2018 16:38

URL #3

А как выглядят кривые без вычета базовой линии?

Carbon Copy
Постоянный участник
So close no matter how far

20.11.2018 19:22

URL #4

Базовую флюоресценцию (fluorescence threshold) отрегулируйте вручную и будет Вам счастье. Хотя меня бы в данном эксперименте больше бы волновала огромная разница между мутантным и нормальным аллелями в 4943 и 4944. Как Вы это обьясняете?

Насчёт низкого уровня флюоресценции я подозреваю оптическую разкалибровку (optical misalignment) Вашего прибора - все реакции ближе к центру плашки показывают пониженную флюоресценцию. Поставьте много одинаковых реакций, распределив их вразброс по плашке - и узнаете, правда или нет.

Nucleoid

21.11.2018 07:04

URL #5

semi, да, дубль проб был в одном ряду, с уверенностью могу сказать, что пробирки чисты и крышки были закрыты плотно. Horse-radish, не было необходимости производить вычет, кривые получились ровными, принудительный вычет кривую не меняет. Carbon Copy, большая разница между аллелями объясняется всего-лишь низкой мутантной нагрузкой образца. Вроде как удалось выяснить, что сниженная флуоресценция не влияет на пороговый цикл Ct, но всё же попробую проверить вашу теорию, спасибо вам за совет.

Horse-radish
Участник

21.11.2018 09:56

URL #6

Кривые, что вы привели, уже с вычетом, поскольку нормированы относительно нуля флуоресценции. Я же спрашивал про вид в режиме "no baseline substracted", исходя из которого можно будет сказать кто виноват. Примерно. Карбон копи тоже к тому и ведет.

Nucleoid

21.11.2018 10:03

URL #7

Horse-radish, да, прошу прощения, неправильно вас понял. Так кривые выглядят без вычета на примере образца 4944. Синим обозначен мутантный тип

Картинки:
картинка: 4944.PNG

4944.PNG — (59.93к)

Horse-radish
Участник

21.11.2018 10:51

URL #8

Тут то все нормально, лучше покажите образцы 4943 или 4945 без вычета.

Nucleoid

21.11.2018 12:43

URL #9

В 4943 дикий тип мутанта - красная кривая и вторая снизу, в 4945 - красные - дикий тип.

Картинки:
картинка: 4943.PNG

4943.PNG — (58.83к)

картинка: 4945.PNG

4945.PNG — (58к)

Horse-radish
Участник

21.11.2018 14:54

URL #10

Калибровка съехала. Чистили прибор давно?
А углы кривых можно немного подправить убрав первые 8-10 циклов из анализа (settings>cycles to analyze)

Nucleoid

22.11.2018 06:57

URL #11

Horse-radish, довольно давно. Да, проскакивала мысль, что нужно почистить, займусь этим перед следующей постановкой. За углы отдельное спасибо, результат становится чуть точнее.

watchesbiz
Постоянный участник

12.11.2021 18:46

URL #12

http://www.authorstream.com/Replicawatches24/
https://about.me/Replicawatches24
https://moz.com/community/users/17050093
https://trello.com/rolexrelicawatches/activity
https://replicarolexwatches.dreamwidth.org/365.html
https://visual.ly/users/watcheshutuk/portfolio
https://www.viki.com/users/watcheshutuk_549/about
https://www.academia.edu/s/14bdb7d4fe?source=link
https://www.slideshare.net/Nowseore/guide-o...ex-watch-online
https://audiomack.com/rolexrelicawatches
https://soundcloud.com/replicarolexwatches
https://www.bagtheweb.com/u/fakerolexwatches/profile
https://www.flipsnack.com/ReplicawatchesUK/...ca-watches.html
https://www.4shared.com/office/zA4L7Rmzea/G...hase_a_Fak.html?
https://codepen.io/Rolexrelicawatches/full/abBEzaQ

Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.

Имя:

Отправка сообщений использует JavaScript операции. В вашем броузере не
установлено/отключено выполнение JavaScript программ. Используйте Netscape Navigator
или Internet Explorer (не ранее 3 версии); убедитесь, что выполнение JavaScript
программ разрешено в настройках вашего броузера.