Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Aglaiaa Участник |
Мне необходимо заклонировать короткий фрагмент ДКН (60bp) в вектор. Это кусочек получится после рестрикции. Планировалось в геле разделить, а затем вырезать кусок геля и желаемый фрагмент почистить. Обычно для этого мы используем Qiagen MiniElute Gel Purification Kit, но, к сожелению, он подходит для фрагментов от 70 bp, а 40 bp уже гарантировано теряются во время очистки. Посоветуйте, пожалуйста, как лучше постутить. P.S. Я умею выделять из геля не только китом, но меня терзают сомнения, что и во всех прочих случаях этот фрагмент будет теряться. |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
|
genseq Постоянный участник |
|
R.J. Dio Постоянный участник |
|
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(genseq @ 03.07.2013 16:13) Проще синтезировать, чем чистить форезом. Но не дешевле. Если не думать. Но если подумать, то синтезировать дешевле. а может его потом на сиквинс Ионом Торрентом ? |
Aglaiaa Участник |
(R.J. Dio @ 03.07.2013 17:13) Спасибо, попрубую его использовать. |
ship Постоянный участник Moscow |
|
Aglaiaa Участник |
(ship @ 03.07.2013 18:44) Спасибо, только кит ко мне будет долго идти, особенно Qiagen'овский. |
RNK Постоянный участник СССР |
Затем надо отфенолить несколько раз, пока вся агароза не уйдет в фенол-хлороформ. Потом попытаться осадить эту ДНК с этанолом или чем-то другим, спермидином, PEGом. Агароза , конечно, частично останется, и осадится вместе с ДНК, что поможет осаждению короткой ДНК. Можно и по-другому, добавить в кусочек геля ТЕ буфера несколько объемов (1-2), инкубировать на 55-65С, чтобы гель немного набух, затем заморозить на -20. После этого отцентрифугировать на максимальной скорости, и из раствора над осадком будут ваш фрагмент, который можно уже клонировать, без дополнительной очистки.
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
Меняя ионную силу и процент спирта в отмывочных растворах можно легко варьировать нижний предел - до 20-30 пн. Предлагаю использовать пока то что есть в наличии в качестве пробного варианта. Можете контролировать процесс моделируя на Маркере от 50 до 2000 пн, который приложу к киту. Агароза и буфер могут быть любыми. Обращайтесь.
|
Aglaiaa Участник |
Я начну с совета от RNK + китом своим, конечно, попробую. |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Aglaiaa @ 03.07.2013 21:38) |
R.J. Dio Постоянный участник |
(RNK @ 03.07.2013 21:20) Растворите кусочек геля с вашей полосой в 60 пн, в 2-4 M гаунидинтиоционате, при нагреве, то есть как обычно делается для очистки на колонках. Затем надо отфенолить несколько раз, пока вся агароза не уйдет в фенол-хлороформ. Потом попытаться осадить эту ДНК с этанолом или чем-то другим, спермидином, PEGом. Агароза , конечно, частично останется, и осадится вместе с ДНК, что поможет осаждению короткой ДНК. Можно и по-другому, добавить в кусочек геля ТЕ буфера несколько объемов (1-2), инкубировать на 55-65С, чтобы гель немного набух, затем заморозить на -20. После этого отцентрифугировать на максимальной скорости, и из раствора над осадком будут ваш фрагмент, который можно уже клонировать, без дополнительной очистки. совет очень плохой- агароза в следовых кол-вах останется неизбежно, а она сильно ингибирует ферментативные реакции. особенно лигирование |
R.J. Dio Постоянный участник |
(-Ъ- @ 03.07.2013 22:10) В китах для элюции из геля или просто для очистки ПЦР продукта теряются (избавляются от) фрагменты ниже 50 пн - так у меня отработано в китах. Меняя ионную силу и процент спирта в отмывочных растворах можно легко варьировать нижний предел - до 20-30 пн. Предлагаю использовать пока то что есть в наличии в качестве пробного варианта. Можете контролировать процесс моделируя на Маркере от 50 до 2000 пн, который приложу к киту. Агароза и буфер могут быть любыми. Обращайтесь. не факт, что дело только в ионной силе- мне кажется, разные сорбенты по-разному связывают фрагменты разных длин. МСогу ошибаться. В любом случае, даже если дело как раз в ионной силе, пока подберешь нужную, пройдет немало времени, экспертом станешь, как Ъ |
vtosha Постоянный участник |
|
R.J. Dio Постоянный участник |
|
RNK Постоянный участник СССР |
(R.J. Dio @ 04.07.2013 09:26) совет очень плохой- агароза в следовых кол-вах останется неизбежно, а она сильно ингибирует ферментативные реакции. особенно лигирование Конечно, какое-то количество агарозы останется при очистки ДНК фрагмента из геля, любым методом известным методом: то ли очисткой колонкой, замораживанием-оттаиванием геля, или экстракцией фенолом. Разве что только электроэлюция позволит хорошо очистить ДНК от агарозы. Я лично бы очищал бы на колонке, даже если выход не высокий. Лигирование ингибируется агарозой, но всё зависит от количества и качество агарозы. Но для успешного лигирования и трансформации не нужно много ДНК. Хватит того, что получится любым методом, что используется. Даже если на форезе не будет ничего видно, трансформация "вытянет" этот фрагмент по любому. |
ERiNaCeUS Участник Москва |
|
RNK Постоянный участник СССР |
|
ОК3 |
(ERiNaCeUS @ 06.07.2013 15:41) Да. Это самое простое. G50 fine лучше будет. Все остальное, вкл рестриктазу "провалится". Переосаждать не нужно, если фрагмент виден - сразу в ТЕ и выход контролировать электрофорезом с маркером 50по |
Aglaiaa Участник |
|
Guest IP-штамп: frYmGqvvNujjc гость |
|
Ivalex Участник |
У меня возникла следующая проблема: привезли штаммы бактерий в транспортной среде с агаром. Попытались выделить ДНК нагревом-заморозкой-разморозкой - получилось (вроде как, Qubit днк там видит). А пцр не идет - видимо из-за остаточного агара в жидкости. Подскажите пожалуйста, как убрать агар/очистить днк из раствора? |
MMM Постоянный участник |
(Ivalex @ 12.05.2017 21:11) 1)Простейший вариант разбавте ДНК по-сильнее. 2) Всеми любимая силка.
|
ship Постоянный участник Moscow |
ну или отфенолить-переосадить? нагрев-заморозак-разморозка - это не выделение днк. это лизис клеток. |
dk Постоянный участник Россия |
Как Вам правильно указывает ship - при криогенном лизисе получается набор всех молекул, а не только ДНК (ещё и непонятной длины), которую Кубит и "видит". Но также в растворе могут быть ингибиторы полимераз, рестриктазы и ещё чёрт знает что препятствующее ПЦР. |
Atropos Постоянный участник abroad |
(RNK @ 07.07.2013 01:58) Можно гель заморозить и оттаять, после этого отцентрифугировать на максимальной скорости, и уже после этого водный раствор профильтровать через "Microcon, Ultracel DNA Fast Flow Membrane", ДНК пройдет фильтр, а фрагменты агарозы застрянут: Можно и просто гель заморозить/разморозить 2-3 раза, отцентрифугировать и внести несколько миеролитров супернатанта в реакцию лигирования (+ порезанный вектор, очищенный так же). Несколько раз успешно так делал и с фрагментами 50-100 bp (полученными рестрикцией либо достроенныех олигов, либо плазмиды). |
Nickkolas Участник |
В легирование можно брать супер без очистки или разбавить водой (если концентрация позволяет), можно почистить супер на силеке и избавиться от T(A/B)E... Сам часто на легирование брал выкрут в 1хTAE (1/5 - 1/6 объема от лигазной смеси), эффективность ниже, чем после очистки (GTC в моем случае), но легируется. |
Ivalex Участник |
(ship @ 13.05.2017 03:21) а нарастить их и выделить из живых нет возможности? ну или отфенолить-переосадить? нагрев-заморозак-разморозка - это не выделение днк. это лизис клеток. Увы, нет. Да, я некорректно выразился. Я таким способом попытался одновременно и лизировать клетки, и сжать агарозу (получая таким образом довольно большое количество супернатанта) А при фенол-хлороформе куда уйдет агароза? |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(Ivalex @ 12.05.2017 21:11) Добрый день! У меня возникла следующая проблема: привезли штаммы бактерий в транспортной среде с агаром. Попытались выделить ДНК нагревом-заморозкой-разморозкой - получилось (вроде как, Qubit днк там видит). А пцр не идет - видимо из-за остаточного агара в жидкости. Подскажите пожалуйста, как убрать агар/очистить днк из раствора? Ваша ошибка - нагревание агара с культурой. Замораживание- размораживание несколько раз и все в должно было быть в порядке. При этом я бы взял соотношение агара к воде 1 к 10 и никакого ингибирования от компонентов агара там не останется. Или выделяйте ДНК китами, где предусмотрена солюбилизация агара, типа элюции ДНК из агарозных гелей. Вообщем, ммм как всегда прав.
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |