Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Как отклеить клетки -- ларчик прост, a вот не открывается --
Компания Biocommerce - официальный дистрибьютер продукции компаний Miltenyi Biotec GmbH (Германия) и RanD S.r.l. (Италия).
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! Леонид В
Постоянный участник
Квебек



 прочитанное сообщение 31.03.2018 05:36     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Задача проста, как банный веник.

Идет скрининг концентрация/время на токсичность. Образцов много, сил мало, т.е. вручную, посадкой 30-ти нанолаборантов с микропипетками не сделаешь.

Плашка 96 л в ней HEK. Нужно, не убирая среды с сывороткой (!) добавить нечто (кокаин, лидокаин, аккутазу не предлагать по финансовым соображениям), чтоб клетки отклеились, но ни одной мертвой не прибавилось.

Сначала думал, что простой встряски плашки будет достаточно. CytoFlex трясет плашку так, что у меня, будь я одноклеточным адгерентным, голова бы сразу отлетела. НЕК-и в особой адгерентности не замечены, но не отлипают. По краям лунки остаётся много прилипших, а мертвые, само-собой смываются все. Результаты, соответственно, неадекватные.

Активное пипетирование 12-каналкой даёт слишком много агрегатов клеток (SSC-W двойной и больше), а мертвые учитываются по одиночке. Результаты, соответственно, неадекватные.

Заливали EDTA, не убирая среды с сывороткой. он убивает клетки за милую душу. Добавляет десяток процентов мертвых (контролем служит фото лунки, где есть hoechst и PI. На фото 1% мертвых, с EDTA - 10%)

Sigma, туды ея в качель, не открывает секрет элексира в котором цитрат, EDTA и почему-то глицерол (зачем ???). Можно, конечно, протестировать кучу-тучу концентраций этих трёх магических веществ, но прежде, чем это делать имею желание спросить. Может кто-нибудь уже бился лбом о подобное?

“Если вы не отзовётесь, мы напишем в researchgate"
Участник оффлайн! Annabel
Участник
Бостон, США



 прочитанное сообщение 31.03.2018 07:31     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

Прямо в таком виде не бились, но похожий протокол у меня есть. В нем конечная концентрация цитрата - 15 mmol, а EDTA - от 2 до 5 mmol.
Участник оффлайн! Леонид В
Постоянный участник
Квебек



 прочитанное сообщение 31.03.2018 09:19     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

(Annabel @ 31.03.2018 00:31)
Ссылка на исходное сообщение  Прямо в таком виде не бились, но похожий протокол у меня есть. В нем конечная концентрация цитрата - 15 mmol, а EDTA - от 2 до 5 mmol.


О! обошлись без “спортлото“, спасибо ...
А у протокола есть ссылка? Вдруг статья будет, рецензенты не любят без ссылки. А конечная концентрация работает в присутствии сыворотки? Ведь в ней, родимой, вся загвоздка. И кальций тоже в ней. Он же, по совместительству, и загвоздка.

Кстати, а какие мысли по поводу глицерола? Что он делает у Сигмы в растворе? (ну, плавает, это понятно, а кроме ?)

Сообщение было отредактировано Леонид В - 31.03.2018 09:21
Участник оффлайн! Annabel
Участник
Бостон, США



 прочитанное сообщение 31.03.2018 23:42     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

Нет, конечно, все из уст в уста. 2mM EDTA - это стандартная концентрация в MACS буфере (ссылка - любой протокол выделения клеток магнитом из суспензии) и в FACS буфере, чтобы не слипалось. Думаю, что коридор до 5 - это на случай дополнительного кальция в среде. В тех же буферах есть BSA до полпроцента, это довольно много, то есть на белок они уже закладываются, сыворотка не очень отличается в этом аспекте, я думаю. Там побольше белка, но не на порядок.
Цитратный буфер я бы просто нагуглила. Вот, например (под лозунгом "не надо так делать со стволовыми клетками!) - https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3907557/ : Relatively high concentrations of sodium citrate, 10 to 15 mM, have long been used for non-enzymatic cell dissociation in flow cytometry where the generation of single cells and preservation of cell surface markers is critical for cell sorting.

Сообщение было отредактировано Annabel - 31.03.2018 23:45

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Леонид В
Участник оффлайн! Annabel
Участник
Бостон, США



 прочитанное сообщение 31.03.2018 23:46     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

С глицеролом в смеси возможно тупо осадок не выпадает солями, а на клетках он практически инертный. Не любит народ преципитаты в покупных буферах.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Леонид В
Участник оффлайн! Леонид В
Постоянный участник
Квебек



 прочитанное сообщение 01.04.2018 03:01     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

(Annabel @ 31.03.2018 16:42)
Ссылка на исходное сообщение  под лозунгом "не надо так делать со стволовыми клетками!) - https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3907557/

Спасибо!

“всё чудесатее и чудесатее“
интересно, какова роль гипертоничности раствора? Сжимает клетки и они отлипают “под давлением“. Может и глицерол каким-то схожим образом действует?
Да-с ... наука - сложная штука. И почему я не пошел в ассенизаторы. Сидел бы сейчас, пил пиво и мечтал бы о судьбе великого ученого, который не как я, в г...не, а весь в белом халате, в высоких материях витает и высокую зарплату получает.

Ну хорошо, допустим у Сигмы 5% glycerol. Он уже не вязкий, т.е. практически как вода. Пипетируется без проблем. Итого, если верить гуглу и калькулятору стибренному у сынишки:
5g/100ml
glycerol = 92.09 g/mol
5/92.09 ~ 0.05 mol of glycerol in 100ml = 0.5 mol/l = 0.5 M

Glycerol is a non-electrolyte, so, its osmolarity and molarity are the same.
0.5 M = 0.5 osM 

Осмотическое давление это π = MRT

M is the molar concentration of dissolved species (units of mol/L).
R is the ideal gas constant (0.08206 L atm mol-1 K-1, or other values depending on the pressure units).
T is the temperature on the Kelvin scale.

будем считать, что идеальный газ и температура, непременно по Кельвину, в Walkersville US и на рідной квебенщине одинаковые.

В статье оптимум, который они доводят хлоридом калия — 0.570 osM

Вам эта цифра ничего не напоминает?

или я совсем химию забыл и нажимаю мимо кнопок в куркуляторе ?

Сообщение было отредактировано Леонид В - 01.04.2018 03:35
Guest
IP-штамп: frRDqEnu8dhhI
гость



 прочитанное сообщение 14.09.2018 19:12     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

(Леонид В @ 01.04.2018 03:01)
Ссылка на исходное сообщение  Спасибо!

“всё чудесатее и чудесатее“
интересно, какова роль гипертоничности раствора? Сжимает клетки и они отлипают “под давлением“. Может и глицерол каким-то схожим образом действует?
Да-с ... наука - сложная штука. И почему я не пошел в ассенизаторы. Сидел бы сейчас, пил пиво и мечтал бы о судьбе великого ученого, который не как я, в г...не, а весь в белом халате, в высоких материях витает и высокую зарплату получает.

Ну хорошо, допустим у Сигмы 5% glycerol. Он уже не вязкий, т.е. практически как вода. Пипетируется без проблем. Итого, если верить гуглу и калькулятору стибренному у сынишки:
5g/100ml
glycerol = 92.09 g/mol
5/92.09 ~ 0.05 mol of glycerol in 100ml  = 0.5 mol/l = 0.5 M

Glycerol is a non-electrolyte, so, its osmolarity and molarity are the same.
0.5 M = 0.5 osM 

Осмотическое давление это π = MRT


https://yandex.ru/video/search?text=%D0%BD%...098262842082759





M is the molar concentration of dissolved species (units of mol/L).
R is the ideal gas constant (0.08206 L atm mol-1 K-1, or other values depending on the pressure units).
T is the temperature on the Kelvin scale.

будем считать, что идеальный газ и температура, непременно по Кельвину, в Walkersville US и на рідной квебенщине одинаковые.

В статье оптимум, который они доводят хлоридом калия — 0.570 osM

Вам эта цифра ничего не напоминает?

или я совсем химию забыл и нажимаю мимо кнопок в куркуляторе ?
Участник оффлайн! watchesonline89
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  05.01.2023 11:50     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

https://omegawatches89.mystrikingly.com/
https://www.deviantart.com/omegawatches89/j...pular-930508248
https://eatsleepride.com/c/383270
https://fortunetelleroracle.com/fashion/ama...s-online-737627
https://www.intensedebate.com/people/omegawatches89
https://fortunetelleroracle.com/fashion-acc...-popular-737613
https://anotepad.com/notes/ykiydhnj
https://medium.com/@omegawatches89/amazing-...ne-b4863ed55af0
https://omegawatches90.mystrikingly.com/
https://62e8ce2ae5d50.site123.me/blog/repli...ve-items-online
https://62e8da780bf7c.site123.me/
https://padlet.com/omegawatches89/9ibenzfwbcer7k71
https://omegawatches89.simplesite.com/452939012
https://62e8da780bf7c.site123.me/blog/excit...-replica-online
https://62e8ce2ae5d50.site123.me/blog/advan...replica-watches

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Клеточные технологии · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 10.04.24 09:11
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft