Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
MMM Постоянный участник |
Попробуйте выведите. Что вы будете оптимизировать, выводя формулу??? --Как я понял, параметры подобраны эмпирически, в каких-то статьях. Как бы это помягче то сказать..... Закон Ома знаете? Диффузию понимаете? В чем ваш вопрос? Почему так и не иначе? Все до безобразия просто. Можно иначе. Но либо все будет долго и расплывётся, либо все будет кипеть и расплываться. Степень неприятностей зависит от уровня вашего мазохизма. --А что по силе тока в ячейке? Закон Ома! Ну, почитайте про носители заряда в растворах и о буферных системах в Лэмли форезе. А лучше поставьте форез и посмотрите, что происходит с током, если напряжение постоянно во время фореза или что происходит с напряжением при постоянном токе. А потом подумайте о причинах наблюдаемых вами явлений. И как это можно использовать на практике. Ну, невозможно здесь лекции писать. -И в некоторых приборах можно стабилизировать мощность, в ваттах, зачем это? Это вроде АБС на машине или подушек безопасности. Мощность ограничивают сверху, что бы предотвратить перегрев системы. В Лэмли это обычно используется крайне редко. В некоторых других ЭФ приложениях может быть весьма полезным. |
X IP-штамп: fr2Aj2u1X7jjo гость |
|
MMM Постоянный участник |
|
Botrytis |
|
Botrytis |
|
MMM Постоянный участник |
|
Botrytis |
|
##Анастасия## |
|
MMM Постоянный участник |
(##Анастасия## @ 28.05.2015 20:17) Здравствуйте! У меня такой вопрос: какую форму будет иметь пятно глицина при электрофорезе при рН=6, если приложить сильное напряжение? 1)Вопрос учебный? 2) Тема, в которой вы задали вопрос, посвящена Э/Ф белков в полиакриламидном геле. Глицин не белок и электрофорез его в ПААГе никто никогда не проводил. В связи с 1) - сами то что думаете по этому поводу. В связи с 2) - надо было для вашего вопроса создать отдельную тему. |
##Анастасия## |
|
Botrytis |
|
MMM Постоянный участник |
У вас какой процентности гель. Даже с 7% гелем еще можно работать аккуратно без разрывов. Есть три подхода первый дорогой: покупаете что вроде GELDOC ОТ Bio-Rad. И все! Второй покупаете китайский плоский светодиодный фонарь( панель )типа: Цифровой фотик. Кладете свой гель на прозрачный бухгалтерский файлик, файлик - на светодиодную панель и фоткаете. Третий покупаете планшетный сканер типа Epson 700V прозрачную пленку для лазерного принтера. кладете на пленку гель, пленку на сканер и сканируете. Обработка обсчет и тд. производится opensoft - imageJ, Если у вас Geldoc у него фирменный софт ImageLab
|
metrim Постоянный участник Москва |
Оно конечно хорошо, что быстро, но 1. такое чувство, что гели стали получаться "немного другими", полосы быстрее убегают 2. для заливки градиентных гелей - времени не хватает. (дегазацию не производил) можно ли как то замедлить процесс ? конечно можно наверное охлаждать гель, но может просто возможно уменьшить кол-во ТЕМЕДа ? |
MMM Постоянный участник |
|
metrim Постоянный участник Москва |
Сколько вообще "нормально" гель должен застывать? |
metrim Постоянный участник Москва |
Что бы не сказывалось негативно на качестве геля. |
criplenie Участник |
(metrim @ 11.04.2017 12:21) Зависит от температуры. Чем выше тем быстрее - я раствор для разгоняющего геля в холодильнике храню (Акриламид + трис + вода без SDS), поэтому застывает он у меня минут 15 на еще реахимовском ПСА (аликвоты храню в морозильнике, переношу в холодильник по мере исчерпания). Если теплый да дегазированный (чем ниже температура воды тем больше в ней кислорода), может застыть в процессе заливки. Концентрацию ПСА и ТЕМЕДа можно смело уполовинить. |
criplenie Участник |
(MMM @ 11.04.2017 07:35) Нееееет!!!!!! Уменьшать надо количество ПСА!!!! И это принципиально!!! ПСА - это инициатор цепи полимера. Чем больше ПСА, тем больше цепей. Чем больше цепей, тем они короче. Чем короче цепи, тем меньше сопротивление среды белку. А разве поперечные сшивки не сильнее влияют на процесс? Делал помимо традиционного 1:29 бискариламида/акриламида, 1:19 для маленьких белков. Так даже маленькие белки в нем продвигались с трудом. А вот вариация ПСА (плюс-минус два раза в обе стороны) ни на что особо не влияла - разброс других параметров поболее будет. |
LMP Постоянный участник |
(metrim @ 10.04.2017 15:09) можно ТЕМЕД перед самой заливкой добавлять (чтобы успеть морально приготовиться )
|
MMM Постоянный участник |
(metrim @ 11.04.2017 12:21) А почему старый биорадовский персульфат "столь бодр" то ? Сколько вообще "нормально" гель должен застывать? Персульфат очень плохой по части устойчивости и качества реактив. И если по чеснаку с каждой новой партией ПСА надо подбирать его концентрацию. Время примерно не меньше 10 минут и не больше 60. При чем чем выше концентрация тем полезнее медленее полимеризовть гель Сообщение было отредактировано MMM - 11.04.2017 14:15 |
MMM Постоянный участник |
(criplenie @ 11.04.2017 13:19) А я разве где-то утверждал обратное? Одно не противоречит другому. |
MMM Постоянный участник |
(LMP @ 11.04.2017 15:00) Чем дольше стоит смесь с ПСА без TEMED, тем короче лаг фаза процесса полимеризации
|
dk Постоянный участник Россия |
|
AMK |
Я в электрофорезе полный ноль. Вообще я списки для закупок составляю. Мне дано задание заказать все реактивы для электрофореза (определение фитогормонов и подобного) для камеры Хеликон VE-10. Ищу уже несколько дней но все равно не понимаю что и в каких количествах надо. Помогите составить список, пожалуйста, что нужно если нет ничего). И я не поняла что такое ТРИС-буфер и как он выглядит в списке химреактивов. Из сотрудников никто помочь не может, потому что разбирается еще меньше чем я. Но начальство сказало делать...и все, никуда не деться... |
Guest IP-штамп: frG1gE1TohpHQ гость |
(AMK @ 19.02.2018 10:29) Из сотрудников никто помочь не может, потому что разбирается еще меньше чем я. Но начальство сказало делать...и все, никуда не деться... это всё очень печально, надеюсь вы работаете в нии, а не на фирме
|
Blaid Постоянный участник |
- акриламид - бисакриламид - трис (трис(гидроксиметил)аминометан) - трис-НСl (либо соляная кислота вместо трис-гидрохлорида) - додецилсульфат натрия (он же SDS) - персульфат аммония - глицерин - бромфеноловый синий - бета-меркаптоэтанол или дитиотрейтол - глицин - протеиновый маркер молекулярных масс - TEMED (тетраметилэтилендиамин) - н-бутанол (или 96% этанол) - дистиллированная или бидистиллированная вода Если будете ставить нативный форез (ну, это обычно юзают для определения активности ферментов), то ещё понадобятся компоненты для буферной системы, обеспечивающей оптимальный рН в геле. А вот если Вы не будете ограничиваться только форезом (вероятно, так и будет, исходя из содержания вашего вопроса), то Вам понадобится довольно много чего ещё (за форезом могут последовать перенос белков на мембрану и собственно сам иммуноблоттинг). Перечисленные реагенты относительно дёшевы и общедоступны (как правило, они есть в большинстве молекулярных и биохимических лабораторий). Вполне можно найти и выпросить (хотя бы на первое время). Если будете покупать (заказывать), то лучше брать реактивы категории for molecular biology или bioultra (но и что попроще и, соответственно, подешевле тоже сойдёт). А тип форезной камеры имеет второстепенное значение (форез он везде одинаков и тип камеры на него не влияет). |
X34 Участник |
(AMK @ 19.02.2018 11:29) Добрый день всем) Я в электрофорезе полный ноль. Вообще я списки для закупок составляю. Мне дано задание заказать все реактивы для электрофореза (определение фитогормонов и подобного) для камеры Хеликон VE-10. Ищу уже несколько дней но все равно не понимаю что и в каких количествах надо. Помогите составить список, пожалуйста, что нужно если нет ничего). И я не поняла что такое ТРИС-буфер и как он выглядит в списке химреактивов. Из сотрудников никто помочь не может, потому что разбирается еще меньше чем я. Но начальство сказало делать...и все, никуда не деться... it makes me cry Цитата тыц раз "Из сотрудников никто помочь не может, потому что разбирается еще меньше чем я" цитата тыц два "я не поняла что такое ТРИС-буфер" и это люди с явно высшим образованием, это ***ец ***, можете меня баниить |
dk Постоянный участник Россия |
А то вообще может оказаться, что Вам не для ПААГ заказывали, а для горизонтального э/ф на агарозе или крахмале. Науке такие случае известны: "У нас есть камера!" - "Какая именно?" - "Хеликон" - "Не производитель, а тип: вертикалка, горизонталка?" - "А не всё ли равно?" |
AMK |
Дешевизна реагентов тут уже не моя проблема) Камера для вертикального фореза. Но наверное это все зря, потому что камеру то они притащили а источника питания к ней нет) |
vb Постоянный участник |
(AMK @ 22.02.2018 07:45) Спасибо) Список есть, теперь буду искать откуда заказать. Все конечно печально, и я несколько утрировала что вот уж прям никто помочь не может, скажем так, никто не хочет. У всех есть свои задачи. Я новый сотрудник в отделе и ни разу в жизни никогда не сталкивалась с такими задачами. Еще раз спасибо) Дешевизна реагентов тут уже не моя проблема) Камера для вертикального фореза. Но наверное это все зря, потому что камеру то они притащили а источника питания к ней нет) Вообще довольно странный подход. Обычно первичную заявку делает тот, кто выполняет контроль, иссследование, анализ. Потому что, как выше сказали , электрофорезов разных очень много в зависимости от задач. Я вот, например, вообще нё в курсе, что фитогормоны электрофорезом анализируют. Думал типа вэжх. Ну и менеджер по закупкам или там лабменеджер не в состоянии знать все нюансы методов. да, возвращаясь, и именно непосредственный потребитель реактивов должен быть больше всех заинтересован в том, что придет именно то, что нужно и тогда, когда нужно. но, если их не интересует результат, то... либо они ничего не делают и всем реально похрену, что вы закупите, либо ситуация заранее провальная, а неумеху-закупщика хотят выставить виновником провала. |
vb Постоянный участник |
1. Потребовал СОП/инструкцию по выполнению метода. В нем обязательно должен быть раздел "материалы/реактивы" с описанием количества, квалификации и даже иногда каталожными номерами конкретных производителей. Согласно этому документу сделал бы заказ. 2. Если инструкции нет или в ней недостаточно описаны реактивы, то доложил бы руководству о несоответствии внутренних документов требованиям ИСО и здравому смыслу и продолжил работу после оформления такого документа. Если ваше положениё не позволяет встать в позу, то можно составить заявку с примечаниями везде, где можно "ориентировочно, так как недостаточно информации". |
dk Постоянный участник Россия |
Уважаемая АМК, похоже Ваш заказчик или идиот (это не лечится), или хочет Вас подставить (т.к. работать не хотят и ищут причину "почему не сделано"). Иначе это совсем уж вариант Алисы и Чеширского Кота: " — А куда ты хочешь попасть? — А мне все равно, только бы попасть куда-нибудь. — Тогда все равно куда идти. Куда-нибудь ты обязательно попадешь. " Прислушайтесь к совету уважаемого vb и при закупке "того, не знаю чего" максимально себя обезопасьте. |
metrim Постоянный участник Москва |
Есть блок питания (фармациевский еще) с выходами для двух камер. Когда я использовал одну камеру, ставил ток 200В 60мА для двух гелей. Правильно ли я понимаю, что при постановке двух камер с 4 такими же гелями нужно будет оставить вольтаж тот же , а предел по амперам удвоить? Я так понимаю, что блок врят ли по каждому отдельному каналу регулируется, вероятно то что выдается и отражается на табло это сумарный ток системы? |
dk Постоянный участник Россия |
|
rafaomx Москва |
МОНА!!! ---Какая здесь разница? а) ДТТ можно класть в два раза меньше чем МЭ по молям. б) ДТТ раз в 10 или больше дороже чем МЭ в) ДТТ менее летучь, менее вонючь, менее токсичен, не требует вытяжки. |
metrim Постоянный участник Москва |
Суть в том, что у меня камера для заливки градиентных гелей под 10 сэндвичей. Мне весьма геморно делать десяток под Лэмли, десяток - под нативный и хранить их. Вот если бы можно было сделать одинаковый (с SDS) градиентный разделяющий, запечатать и хранить, а потом просто разный концентрирующий заливать и юзать в соответствии с потребностями - вот это было бы сподручней. |
Vadim Sharov Постоянный участник Россия |
(metrim @ 02.01.2019 12:27) Проще использовать гели без SDS для денатурирующего фореза. SDS в буфере и образце достаточно, чтобы форез был денатурирующем.
|
metrim Постоянный участник Москва |
(Vadim Sharov @ 08.01.2019 14:48) Проще использовать гели без SDS для денатурирующего фореза. SDS в буфере и образце достаточно, чтобы форез был денатурирующем. Есть ли уверенность, что SDS из концентрирующего геля будет достаточно, что бы уравновесить разделяющий гель перед фронтом образца? Если по идее "можно не добавлять", почему во всех рецептурах SDS в разделяющий гель прописан и не встречается примечаний "в приципе можно и не добавлять". Разумеется универсальный ответ: "попробуй сам , посмотри на результат", но у меня недостаточно квалификации, что бы предусмотреть различные варианты и вовремя заприметить , что "что то идет не так". Маркеры разумеется я прогоню, цитохром. Еще вопрос возник: иногда в рецептурах в низкопроцентные гели встречается добавление глицерина. Я попробовал добавить 5 и 10%, результат мне понравился, гели стали более эластичными, прочыми. Вопрос: есть ли ограничения в этой добавки, в каких масштабах стоит использовать глицерин, почему он если так хорош - не является стандартным компонентом рецептур? |
MMM Постоянный участник |
(metrim @ 11.01.2019 01:41) Есть ли уверенность, что SDS из концентрирующего геля будет достаточно, что бы уравновесить разделяющий гель перед фронтом образца? Если по идее "можно не добавлять", почему во всех рецептурах SDS в разделяющий гель прописан и не встречается примечаний "в приципе можно и не добавлять". Есть! Проверено экспериментально. Ведь SDS прет в гель из электродного буфера, а там его до попы. (metrim @ 11.01.2019 01:41) Еще вопрос возник: иногда в рецептурах в низкопроцентные гели встречается добавление глицерина. Я попробовал добавить 5 и 10%, результат мне понравился, гели стали более эластичными, прочыми. Вопрос: есть ли ограничения в этой добавки, в каких масштабах стоит использовать глицерин, почему он если так хорош - не является стандартным компонентом рецептур? Ограничения есть! Начиная с 25-30% начинают ползти рН в гелях и резко возрастают электро сопротивления в гелях что влияет на концентрирование в зонах, иногда появляются шлейфы из-за худшей растворимости белка в зонах концентрирования. Что касается стандартного улучшайзинга. То прошли те времена 50х-70х годов, когда улучшайзинг становился предметом научных исследований и достоянием общественности ботанов-научников. Теперь этим занимаются технические "Маши с трудоднями" на R&D компаний, а улучшайзиг превращается в знаюкаки компаний. Сообщение было отредактировано MMM - 11.01.2019 08:17
|
metrim Постоянный участник Москва |
(MMM @ 11.01.2019 08:46) Ну т.е. процентов до 10 глицерина в 6-10-15% гелях проблем быть не должно?Что касается стандартного улучшайзинга. То прошли те времена 50х-70х годов, когда улучшайзинг становился предметом научных исследований и достоянием общественности ботанов-научников. Теперь этим занимаются технические "Маши с трудоднями" на R&D компаний, а улучшайзиг превращается в знаюкаки компаний. Ну это то да, но продолжают же издаваться учебные пособия и там все без изменений с 70-х годов или там "афффтары" тупо бездумно перепечатывают чужое?
|
MMM Постоянный участник |
(metrim @ 11.01.2019 12:18) Ну это то да, но продолжают же издаваться учебные пособия и там все без изменений с 70-х годов или там "афффтары" тупо бездумно перепечатывают чужое? А почему бы и нет. Требований новизны к учебным пособиям не предъявляются |
Vadim Sharov Постоянный участник Россия |
Нормальный автор пособия никогда не напишет "можно не добавлять", потому что опыт обязан быть единообразным, а значит повторяемым. Каждое " можно не" снижает методическую однообразность эксперимента. То, что эксперименты 70х прошлого века методически сходны с современными позволяет их достоверно сравнивать, а значит не переповторять. Все остальные "можно не" из области "примочек" "tips". Объект обмена опытом на профессиональных форумах. Более того, стандартность позволяет работать с электрофорезом исследователям, не получавшим химического или биохимического образования, не заморачиваясь скоростью и направлением диффузии заряженных молекул под воздействием электрического поля. Как верно написал МММ, то что гель без SDS берет SDS из буфера многими (включая меня) проверено на собственной практике. Но пользоваться этим знанием нет смысла, на SDS нелепо экономить. Ставит производство одинаковых гелей для разных методик на поток я считаю нецелесообразным. Проще в заливочную камеру на 10 гелей вставить стандартную вкладку (они поставляются с большинством стандартных наборов для заливки). Если у вас заказная самоделка, то целесообразней заказать пластиковый параллелепипед - вставку, а не заливать все 10 гелей.
|
hopfen Участник |
(Vadim Sharov @ 12.01.2019 17:19) В биохимии принято, что буфер в геле должен совпадать с форезным буфером. Нормальный автор пособия никогда не напишет "можно не добавлять", потому что опыт обязан быть единообразным, а значит повторяемым. Каждое " можно не" снижает методическую однообразность эксперимента. То, что эксперименты 70х прошлого века методически сходны с современными позволяет их достоверно сравнивать, а значит не переповторять. Все остальные "можно не" из области "примочек" "tips". Объект обмена опытом на профессиональных форумах. Более того, стандартность позволяет работать с электрофорезом исследователям, не получавшим химического или биохимического образования, не заморачиваясь скоростью и направлением диффузии заряженных молекул под воздействием электрического поля. Как верно написал МММ, то что гель без SDS берет SDS из буфера многими (вклячая меня) проверено на собственной практике. Но пользоваться этим знанием нет смысла, на SDS нелепо экономить. Ставит производство одинаковых гелей для разных методик на поток я считаю нецелесообразным. Проще в заливочную камеру на 10 гелей вставить стандартную вкладку (они поставляются с большинством стандартных наборов для заливки). Если у вас заказная самоделка, то целесообразней заказать пластиковый параллелепипед - вставку, а не заливать все 10 гелей. |
hopfen Участник |
|
watchesbiz Постоянный участник |
|
Shikooo Постоянный участник |
|
Ufa1688 Постоянный участник |
|
Ufa1688 Постоянный участник |
|
Macanbola IP-штамп: frxwqRM9LKN8w гость |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |