molbiol.ru -> 3 пика в кривой плавления Sybr GrEEn

> Все форумы > Тематические форумы > Молекулярная и клеточная биология

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ

Правила FAQ* Поиск* Участники* Календарь* Избранные темы* Форум Форумов*

Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ]

Форум:

* 3 пика в кривой плавления Sybr GrEEn

Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.

irusia
Участник
Göttingen, Germany (Piter, Russia)

30.08.2005 16:24

URL #1

Дорогие коллеги, помогите чайнику, пожалуйста. Осваиваю real time PCR с SYBR GREEN. Получила тут замечательную кривую плавления с тремя пиками - на 82, 85 и 88 градусов. Вот сижу и думаю, что же это может быть такое. Первый и третий пик маленькие, второй - большой. Ну, ладно, первый пик - скорее всего димеры праймеров, второй - продукт, а третий-то - хто? На форезе четко вижу продукт и димеры. Вот уже полголовы сломала, откуда третий пик мог взяться?

Headman
Участник

30.08.2005 16:56

URL #2

Эксперимент повторяется или это единичный случай?

Сколько пиков имеет кривая плавления в случае, если ты ставиш Q-PCR с другой парой праймеров?

Как были подобраны праймеры, какую программу использовали?

genseq
Постоянный участник

30.08.2005 17:17

URL #3

Вряд ли это праймеры. Скорее всего, пики отражают содержание в амплифицированной ДНК участков, отличающихся по температуре плавления.

irusia
Участник
Göttingen, Germany (Piter, Russia)

30.08.2005 18:30

URL #4

To Headman

Эксперимент был один, но были исследованы кДНК и плазмида с нужным геном (для контроля), и в обоих случаях три пика с теми же праймерами.

Поскольку это мой самый первый эксперимент, то другие праймеры к данному продукту пока не пробовала. Эти праймеры мне достались по наследству, потому как в других руках (на другой real time машине) они работали, причем в кривой плавления был один пик. Как они подбирали праймеры, не знаю.

Еще я заметила, что при понижении концентрации праймеров с 300nM до 50nM третий пик уменьшается (второй правда тоже, но ненамного).

Headman
Участник

30.08.2005 21:04

URL #5

С каким температурным шагом происодит измерение флуоресценции? и с каким шагом потом (см. далее, delta T) происходит вычисление кривой плавления?
В идеале, конечно, по оси ординат хотелось бы видеть -dF/dT , а в реале откладывается -delta F/ delta T, а по абсциссе - откладывается средняя величина температуры, то есть, в данном случае, delta T/2 .

Так вот, некоторые софты позволяют варьировать эту дельту, от чего , соответственно, очень сильно будет зависеть и сам вид кривой плавления. Обрати на это внимание, - может так получиться, что этот пик - математический фантом.

Headman
Участник

30.08.2005 21:08

URL #6

да, и запомни, что "один эксперимент - это не эксперимент" :-)
и никогда не следует в таком случае делать далекоидущие выводы, - может оказаться, что это неудавшийся из-за каких-либо причин эксперимент

Guest
IP-штамп: frlnAsDr.5x7A
гость

31.08.2005 09:22

URL #7

хедмен имел ввиду, что тебе нужно просто сгладить кривую, и возможно лишние пики уйдут сами собой. а каккая конечная температура при постановке эксеримента?

serge11
Участник

31.08.2005 20:30

URL #8

А на обычном форезе какая картина? Если там три полосы амплифицировалось, тогда нет вопросов.
Сателитный пики могут быть димеры праймеров или не специфика.

irusia
Участник
Göttingen, Germany (Piter, Russia)

01.09.2005 12:56

URL #9

(serge11 @ 31.08.2005 18:30)

А на обычном форезе какая картина?

Вот такая картинка
первые три дорожки - амплифицированная к ДНК (различие между дорожками - разные концентрации праймеров)

справа 2 дорожки - плазмида с интересующим геном

Картинки:
картинки уже нет на сайте: DAT_040_IS_10805_p53_qPCR.jpg

картинки уже нет на сайте: DAT_040_IS_10805_p53_qPCR.jpg

DAT_040_IS_10805_p53_qPCR.jpg — (8.66к) 01.09.2005 — 08.09.2005

genseq
Постоянный участник

01.09.2005 14:03

URL #10

Отличная картинка. Амрликон только один, так что Ваши пики, скорее всего, отражают неоднородность его нуклеотидного состава. Ну и чему здесь удивляться?

irusia
Участник
Göttingen, Germany (Piter, Russia)

01.09.2005 15:07

URL #11

To genseg

То есть Вы считаете, что с такой кривой жить можно?
Нижняя кривая - концентрация праймеров 50nM
2 верхние, почти сливаются - 300 и 650

Сообщение было отредактировано irusia - 01.09.2005 15:19

Картинки:
картинки уже нет на сайте: scan0001.jpg

scan0001.jpg — (372.28к) 01.09.2005 — 08.09.2005

genseq
Постоянный участник

01.09.2005 15:58

URL #12

Насколько я понял, это график первой производной. Для первой производной ничего странного не вижу. Вот если бы сама флуоресценция выбрасывала подобные коленца, то я бы тогда сильно удивился и бросился за консультациями к специалистам molbiol.ru .

irusia
Участник
Göttingen, Germany (Piter, Russia)

01.09.2005 16:04

URL #13

genseq, спасибо за ответ!
Да, это график первой производной.
Вы уж простите, что оторвала от дела, в первый раз, знаете ли, удивляет все и вся

а посоветоваться в лабе не с кем

Сообщение было отредактировано irusia - 01.09.2005 16:05

nigoal123
IP-штамп: fr/1ZkUsuBQOE
гость

23.05.2022 12:02

URL #14

The secret to 123GOAL good article writing is to 11hilo understand how สล็อต123 to plan and structure a บาคาร่าออนไลน์ piece before slotxo you write it.

A well-structured ลิงค์รับทรัพย์ article allows you to use nigoal your writing skills to sexy gaming best advantage and dreamgaming communicate your ideas nigoal 50รับ100 correctly, concisely, clearly, coherently, and completely.

guest: 123
IP-штамп: frJhOCvSv9ICE
гость

02.06.2022 12:22

URL #15

For years there 123VEGA have been FA CHAI SLOT calls for Asia - which JILI SLOT is home to some PRAGMATIC PLAY of the world's สล็อตPG biggest CO2 emitters - to ditch fossil fuels 11HILO to help tackle climate AMB CASINO change. Countries in the region - including FC SLOT its three biggest economies 88KTC China, Japan and India - were criticised last year 123GOAL for not making a bigger.

Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.

Имя:

Отправка сообщений использует JavaScript операции. В вашем броузере не
установлено/отключено выполнение JavaScript программ. Используйте Netscape Navigator
или Internet Explorer (не ранее 3 версии); убедитесь, что выполнение JavaScript
программ разрешено в настройках вашего броузера.