molbiol.ru -> Дырка при амплификации плазмиды

> Все форумы > Орг.вопросы и общение > Беседа

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ

Правила FAQ* Поиск* Участники* Календарь* Избранные темы* Форум Форумов*

Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ]

Форум:

* Дырка при амплификации плазмиды -- нужны ваши советы! --
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.

igenetic

Москва

07.10.2019 17:14

URL #1

Коллеги, может быть вы сталкивались с похожей ситуацией.

Амплифицирую плазмиду размером 4,5 кб с полимеразой Phusion HotStart Fermentas.

Реакцию ставлю с двух фосфорилированных праймеров. Один прямой имеет с 3'-конца копмлементарные матрице 20 нуклеотидов и 20 нуклеотидов на 5'-конце некомплементарные. Обратный праймер полностью комплементарен части матрицы с tac-промотором, таким образом, что на его 5'-конце находится область ТА-богатая область -10.

Так вот. Реакция проходит, и при последующем лигировании плазмида зашивается в кольцо, НО. Почти во всех клонах содержится делеция со стороны R-праймера, где область -10. Как правило отсутствуют все 6 букв, иногда меньше. Этот праймер заказывала новый и переставляла реакции с разными температурами отжига. Загадка в том (повторюсь), что делеция в итоговой плазмиде только со стороны обратного праймера, в области -10.

Может быть у вас есть какие-то мыли и рекомендации, как избежать такую делецию?

guest: petr
IP-штамп: frvKCqje1sDbE
гость

12.10.2019 19:19

URL #2

Посмотреть бы на люратный праймер...
Ну первое что приходит в голову, образование вторичной структуры на конце праймера или амплифицированной плазмиды. Если есть возможность, то я бы удлинил обратный праймер с 5`конца чтобы сделать этот конец более тугоплавким

guest: petr
IP-штамп: frvKCqje1sDbE
гость

12.10.2019 19:19

URL #3

Посмотреть бы на обратный праймер...

Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.

Имя:

Отправка сообщений использует JavaScript операции. В вашем броузере не
установлено/отключено выполнение JavaScript программ. Используйте Netscape Navigator
или Internet Explorer (не ранее 3 версии); убедитесь, что выполнение JavaScript
программ разрешено в настройках вашего броузера.