Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* primer design progs
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! the stranger
Участник



 прочитанное сообщение 16.07.2004 11:52     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Коллеги! На форуме обсуждаются некоторые программы для подбора праймеров. Например, Primer Premier или Beacon Designer. Есть еще Oligo (название точно не помню), ну и, наверное, масса других программ подобного рода. Хочу спросить у знающих людей чем они отличаются, если вообще отличаются. Какие у них преимущества и недостатки? Лично я подбираю праймеры в Vector NTI. Но, может быть, я чего-то не понимаю?! confused.gif
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 16.07.2004 12:24     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

Очень хороший вопрос. Всю жизнь подбираю праймеры на Oligo 4 (работает под DOS). Пытался освоить Oligo 6, но безуспешно. Работать, конечно, можно, но всё не так наглядно. Хорошо бы поучиться у знатоков.
Участник оффлайн! AlexRider




 прочитанное сообщение 16.07.2004 17:59     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

Успешно работаем с GeneRunner (он freeware в сети). С подобранными им праймерами не было ни одного прокола.
Участник оффлайн! lokh
Участник



 прочитанное сообщение 17.07.2004 01:30     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/pr...primer3_www.cgi

tam i dlia TaqMan udobno
Участник оффлайн! Esya
Постоянный участник
PA, USA



 прочитанное сообщение 17.07.2004 01:36     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес  ICQ
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

Автор - AlexRider:
Успешно работаем с GeneRunner (он freeware в сети). С подобранными им праймерами не было ни одного прокола.
Так их головой подбирают, а не только программой.
Участник оффлайн! lokh
Участник



 прочитанное сообщение 17.07.2004 01:40     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

nea, rukami ih podbiraut
Участник оффлайн! DmitriM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 17.07.2004 02:19     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

Еся: Ну хорошо, а куда Вы голову прикладываете при подборке праймеров? Температуру он лучше Вас посчитает, GC-состав тоже. Ну, там, разные экзоны и т. п. - это конечно, но сами химико-физические параметры, по-моему, лучше программе оставить.
Лично я пльзуюсь Primer3 и никогда по вине праймеров неудач не имел.
Участник оффлайн! Петровичъ
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 17.07.2004 09:39     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

Я пользуюсь Vector NTI (крекнутым естественно wink.gif ) для обычной ПЦР, для реал тайма, для клонирования...вроде не подводит...единственное, для аллель специф ПЦР , имхо, лучше Oligo.
Участник оффлайн! Veshka
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 17.07.2004 13:48     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

Да, головой и руками луЧЧе lol.gif
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 17.07.2004 15:37     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

В обобщённом виде проблема не одна, а две:
1. Как подбирать праймеры?
2. По какой последовательности их подбирать.

Знатоков много, но у каждого свои воззрения. Одни советуют на 3'-конец ставить G, другие утверждают, что это противопоказано. В Oligo тугоплавкие 3'-концы отбраковываются, тогда как в литературе полно этого "брака". Так что по первой проблеме хотелось бы подискутировать. Что касается второй (выбор последовательности), то тут тоже всё не так-то просто.

В GenBank полно близких последовательностей и их можно легко перепутать - взять не тот штамм или мутантный вариант, отличающийся от имеющейся матрицы. Например, вирусы, особенно РНКовые, чрезвычайно вариабельны. Мне доводилось рассчитывать праймеры на ГЛПС, герпесную группу, онкогенные типы HPV, SARS и многие другие возбудители. Часто задачки оказывались головоломными, но вполне разрешимыми. Давно подбираюсь к HIV, но даже боюсь начинать. Эта головоломка, похоже, слишком сложна. Какие есть мнения по этому поводу?
Участник оффлайн! AlexRider




 прочитанное сообщение 17.07.2004 15:40     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

[quote]Автор - Esya:
[/quote]Так их головой подбирают, а не только программой. [/QB][/QUOTE]

Дык голова вместе с серыми клеточками к компутеру по дефолту прилагается в большинстве случаев. smile.gif
Участник оффлайн! yack
Постоянный участник
Москва, Россия



 прочитанное сообщение 17.07.2004 15:42     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

Десять лет уже вручную подбираю, все просто чудесно
Участник оффлайн! Veshka
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 18.07.2004 00:11     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

Ничего головоломного в хиве особо нет. Попробуйте тубик, аллель-специфические lol.gif lol.gif
Участник оффлайн! a26
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 18.07.2004 00:33     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #14 множественное цитирование

Вешка, я давняя читательница-почитательница ваших постов. Вы производите впечатление профессионала высокого класса. Как вы все-таки делаете design of primres? Мне очень интересно.
Участник оффлайн! Veshka
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 18.07.2004 10:12     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #15 множественное цитирование

Спасибо за комплимент, но спросили у сороконожки... Когда-то я это знал. Кое-что помню.
1. Вредно не G на праймере, а G после праймера. Но вообще пиримидины в праймерах рулят smile.gif
2. Состав конца сложный вопрос. Лучше всего что-нибудь типа SWWWSSWT или SWSWWSWC
3. Праймеры <19 при GС<60% - suxxx. И не спрашивайте, почему. Эмпириццки. Оптимальная длина при средней температуре по больнице -22-23.
4. Стретчи одной буквы - главный враг писиарщика.
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 18.07.2004 14:44     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #16 множественное цитирование

Автор - Veshka:
Ничего головоломного в хиве особо нет. Попробуйте тубик, аллель-специфические    lol.gif     lol.gif 
Узнать бы ещё, что такое "тубик" confused.gif . Да и про аллели у HIV желательно поподробнее frown.gif .
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 18.07.2004 15:02     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #17 множественное цитирование

Автор - Veshka:
1. Вредно не G на праймере, а G после праймера. Но вообще пиримидины в праймерах рулят       smile.gif      
2. Состав конца сложный вопрос. Лучше всего что-нибудь типа SWWWSSWT или SWSWWSWC
3. Праймеры <19 при GС<60% - suxxx. И не спрашивайте, почему. Эмпириццки. Оптимальная длина при средней температуре по больнице -22-23.
4. Стретчи одной буквы - главный враг писиарщика.
1. Про G после праймера непонятно. И как рулят пиримидины? Если имеется в виду "rules", то пурины предпочтительнее. По вкладу в специфичность: A>G>C>T. Есть другие мнения?
2. Состав 3'-конца с учётом только S или W выбирать нельзя.
3. Не спрашиваю, почему suxxx. Но что такое suxxx? Длина (при нынешней дешевизне синтеза) зависит от задачи, но, как правило, зашкаливает за 30N, а "температура по больнице" - за 60.
4. Стретчи (повторы) вредны, но только на 3'-конце. Главные враги - внутрипраймерные и межпраймерные залипания (особый случай - димеры), а также внутрипраймерные и межпраймерные (ампликонные) тугоплавкие шпильки.

Есть другие мнения?
Участник оффлайн! gostya
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 18.07.2004 15:14     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #18 множественное цитирование

не вдаваясь в подробности, рулят - хорошо, suxxx - плохо
другие мнения... имхо, если структура верна, праймеры так или иначе работают, программы помогают оптимизировать процесс, праймеры короткие и низкотемпературные хорошо для сиквенса, праймеры длинные хорошо для ПЦР, праймеры не работают, если структуру в GenBank послал какой-то идиот, а Вы на нее купились
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 18.07.2004 16:52     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #19 множественное цитирование

И всё-таки. Почему пиримидины лучше пуринов? Желательно вдаваясь в подробности.
А за словарик спасибо.
Участник оффлайн! Veshka
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 18.07.2004 17:44     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #20 множественное цитирование

Генсек, Вы, простите, похоже говорите (в который раз) по учебнику, а я, извините, по амплификатору.

"Мозес Аронович не свинья ??? Ну, Вы меня извините!!!" (с) Исаак Моисеевич

Тубик - это, блин, тубик. Те, кто с его GC составом один раз поцеловался, больше его болезного (самого, кстати, болезного по данным ВОЗ) не забудут никогда smile.gif

2Gostya. Вообще работает всё, в определённых условиях, но Вам никогда не приходилось видеть, как легкоплавкие праймеры отжигаются на левое место даже при завышенной (для них) температуре? Это Вы с GC мало возились...

Почему пиримидины лучше? А фиг его знает... Я же сказал, что как сороконожка буду. Накопленные и не систематизированные эмпирические данные. По Г... была какая-то ссылка по элонгации через это Г... я посмотрел - воспроизводится, даже без риал-тайма видать.

А что касается преимущественной элонгации, то это вы, Генсек, просто статей мало читали, потому так уверенно пурины и пиримидины в три шеренги на подоконнике строите...
Участник оффлайн! gostya
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 18.07.2004 18:25     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #21 множественное цитирование

легкоплавкие праймеры отжигаются на левое место даже при завышенной (для них) температуре
это при ПЦРе? почему спрашиваю, потому что, например, при сиквенсе отжиг ведут при 37, так что там длинные праймеры и без GC отжигаются где попало, ну а уж GC сиквенировать этим пусть мазохисты занимаются, извините
Участник оффлайн! Veshka
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 18.07.2004 18:35     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #22 множественное цитирование

Да, при PCR, особенно это характерно для GC-богатых геномов smile.gif , а также для праймеров с гомоолигомерами :-|
А зачем это сиквенс при 37 отжигать? Вроде все как бы термосеквеназой и производными от неё пользуются...

К вопросу о том, как размножаются ёж...извините отжигаются праймеры, я бы посоветовал (это я Вам, Генсек, эксклюзив, можно сказать) сконструировать non-redundant панельку праймеров под...мнэээ лидеры тяжёлых цепей антител человека длиной эдак в 18-22, а потом изучить на этом показательном примере поведение некомплементарных 3'-концов. Может быть тогда вопросы о тм где и чего в праймерах важнО отпадут сами.
Участник оффлайн! gostya
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 18.07.2004 18:42     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #23 множественное цитирование

потому что лет 5 назад мы секвенировали секвеназой, кстати я тогда как-то делала в параллели с термосеквеназой, было ненамного лучше, и потом ПЦРник жалко было, он у нас один тогда был
Участник оффлайн!




 прочитанное сообщение 18.07.2004 19:30     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #24 множественное цитирование

Автор - yack:
Десять лет уже вручную подбираю, все просто чудесно
10 лет не срок, вручную можно и дольше.
Я вот уже не первую сотню пар праймеров для RT PCR подбираю с помощью Primer3, что характерно без проколов. Интересно, мне бы 10 лет хватило все это вручную сделать? А еще интересно, нафига это нужно?
Участник оффлайн! Veshka
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 18.07.2004 21:31     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #25 множественное цитирование

2Gostya Понятно. Непонятно только почему термосеквеназа работала сравнимо плохо. Мы тут как-то в преддверии кучи сиквенсов поизвращались, наделали штоффелей, вариантов термосеквеназы, того-сёго павлина-мавлина, и всё работает замечательно. Может тогда кит поддох - секвеназные это умели, да и термосеквеназные тоже, заварки жалели, фармацевты-амершамщики, не скажу-чьи-дети lol.gif

Нафига? Подбор вручную труден первый год, потом это занимает меньше времени, чем жать на какие-то-там-кнопки в программе, которые обычно бывают с хреноватейшим GUI smile.gif
Участник оффлайн! alex2345
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 19.07.2004 12:27     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #26 множественное цитирование

To Veshka и yack:

Я подбираю вручную только для сиквенса и обычного PCR. Хотя если хочется баз проколов, то больше доверяю программе. А подобрать хорошую пару праймеров для QPCR вручную считаю вообще невозможным.
Если вы вручную просчитываете такие параметры как:
3' Pentamer Stability
Overall Stability
Unique 3' Sequence of 7 bp
<= 2 bp Dimer Duplexing
<= 2 bp Hairpin Duplexing,

то снимаю перед вами шляпу.
Участник оффлайн! Veshka
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 19.07.2004 14:58     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #27 множественное цитирование

3' Pentamer Stability
Запросто. Игрушки с праймер-директед мутациями показывают, что имеет смысл тример stability, не более, если праймер нормальный в целом.

Overall Stability
элементарно

Unique 3' Sequence of 7 bp
это что значит? если чтобы внутренних отжигов не было, так это опять же игра не на том. эта характеристика ИМХО вредная

<= 2 bp Dimer Duplexing
<= 2 bp Hairpin Duplexing,

а это что значит?8-/? праймер димеров вручную избежать тоже элементарно. Для справки. Один мой знакомый написал в МатЛабе прогу для отлова димеров от 3 до скольки-то с конца включая неполные и прогнал мой сет антительных праймеров что-то штук сорок. Был найден один проблемный вариант, изведён в три буквы что ли...

по-моему это всё вопрос практики...но если праймеры делать раз в год, может луЧЧе и софтом, а лучше пусть тогда кто-то ещё делает...
Участник оффлайн! Fedo
Постоянный участник
Nemetchina



 прочитанное сообщение 19.07.2004 15:09     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  ICQ
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #28 множественное цитирование

Автор - lokh:
http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/pr...primer3_www.cgi

tam i dlia TaqMan udobno
Chto-to ssylka u menja ne rabotaet... Tol'ko nachinaju rabotat' S PCR, 1 svoi primery podbirali vruchnuju, poetomu interesno bylo by posmoret' na programmy...
Участник оффлайн! alex2345
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 19.07.2004 15:48     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #29 множественное цитирование

To Veshka:

Элементарно и запросто - не катит.
Даются последовательности - 10 штук размером 3-4 кб. Требуется пара праймеров с минимальным отличием в Tm без образования (т.е. меньше-равно 2 bp) димеров и hairpin структур. Размер амплифицированного продукта - 80-150 bp. Праймер должен быть уникален как минимум 7 bp на 3ь-конце , т.к. амплифицируется cDNA pool.
Участник оффлайн! Veshka
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 19.07.2004 21:55     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #30 множественное цитирование

Катит-не катит... я же предупреждал, что будет сороконожка. У Вас не катит, у меня - катит. В таких терминах вопрос неинтересный - Вас же никто не заставляет, пользуйтесь чем хотите smile.gif

80-150 bp это вообще не вопрос - праймеры можно делать вкривь и вкось - всё равно получится smile.gif
Про димеры ещё раз. ЭТО ЛЕГКО. Шпильки??? Наплюйте. Из опыта.
А в чём проблема уникальности 5'-конца???
По-моему задачка, которую приводил я сложнее - выдернуть "правильное" антитело используя ОДНОВРЕМЕННО праймеры для лидеров (18-24 штука) чтобы не уродовать истинный N-конец. Посмотрите на эти лидеры на досуге - поймёте, почему smile.gif

ДРУГОЕ ДЕЛО если Вы хотите чтобы это всё работало в quantitative... Но там в первую очередь всё будет сильно зависеть состава матриц - я бы их нормализировал сначала ghjcnj сибром, сли они различаются по GC а для этого программы тоже не нужны...
Участник оффлайн!




 прочитанное сообщение 20.07.2004 01:41     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #31 множественное цитирование

Давно там делаю
http://www.idtdna.com/SciTools/SciTools.aspx
or:
http://www.invitrogen.com/content.cfm?pageid=9716
Участник оффлайн!




 прочитанное сообщение 20.07.2004 01:44     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #32 множественное цитирование

Особенно помогает если тыжелие олиги по 60- 70

[Текст переведён с транслита]
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 20.07.2004 10:32     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #33 множественное цитирование

Вот неполный перечень отличительных особенностей праймеров, которые подбирались недавно для мультипраймерной (из 5 пар) системы:
1. Легкоплавкость 3’-концов (ΔG не ниже –9,0). Это снижает фон неспецифических реакций.
2. Повышенное содержание пуриновых оснований (A и G) на 3’-концах. Это также влияет на их специфичность.
3. Минимизирована вероятность межпраймерных и внутрипрайменых взаимодействий (введены корректирующие замены, устраняющие межпраймерные взаимодействия и нежелательное формирование шпилечных структур).
4. Температуры плавления ™ всех праймеров превышают 65° и в большинстве случаев составляют около 70°.
5. В некоторые праймеры введены 5’-концевые нуклеотидные замены, повышающие их Tm.
6. Праймеры не формируют шпилек с Tm более 30°.
7. Комплементарные праймерам участки анализируемой ДНК не участвуют в формировании тугоплавких шпилек.
8. Межпраймерные участки ампликонов не содержат тугоплавких шпилечных структур, затрудняющих полимеразную реакцию.

Интересно было бы узнать, действительно ли G рядом с праймером может влиять на инициацию? Может быть, праймер в экспериментах "сороконожки" просто частично накладывался на тугоплавкую матричную шпильку (см. п.7)?

И ещё. Очень не рекомендую праймеры с повышенным содержанием пиримидинов (особенно T) на 3'-конце. На этом я уже обжигался.

Хорошо бы узнать, кто ещё обжигался, и на чём именно. Хорошая ошибка может оказаться полезнее множества безошибочных опытов.
Участник оффлайн! Павел
Постоянный участник
Новосибирск



 прочитанное сообщение 20.07.2004 11:28     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #34 множественное цитирование

какой топик оказался интересный. Все хотел рассказать пример, да случая не было. Вот для вас, genseq, сообщу, для интереса. Давеча синтезировали ген при помощи PCR, куча олигов (17 штук), да не один, а несколько (для каждого свой набор олигов, ессно), дык вот был затык в одном случае. После долгого разбирательства нашел, что "виноват" олиг 7.
Вот такой структуры:
CTGGCCAAGAAGATCCTGAAGGAGCCCGTGCACGGCGTGGCCGACTCCGG
один из его "димеров" имел энергию образования -18,1 kkal/mol. О как!
Заменой всего одного нуклеотида (молчащая мутация Pro->Pro)
CTGGCCAAGAAGATCCTGAAGGAGCCTGTGCACGGCGTGGCCGACTCCGG удалось снизить энергию до -4.8 kkal/mol. И все получилось.
Ох, и достал он меня, этот ген!!!!! weep.gif cool.gif
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 20.07.2004 12:04     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #35 множественное цитирование

Спасибо за пример. Структура, действительно, показательная. И замена С на T вполне логичная. Устраняет внутрипраймерное залипание. Я бы ещё обратил внимание на внутрипраймерную шпильку с Tm=73. Если отжиг проводить при меньшей температуре, то она может мешаться. Но больше всего смущает ...ССGG на 3'-конце. Для диагностического праймера это почти смертельно, так как даёт праймерный димер. При сборке генов и небольшом количестве циклов амплификации это несущественно.

Кстати, Вы собирали ген из коротких ампликонов сплайсингом in vitro, через сайты рестрикции (на 5'-конце есть HaeI или BalI) или просто лигировали олиги?
Участник оффлайн! Павел
Постоянный участник
Новосибирск



 прочитанное сообщение 20.07.2004 12:17     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #36 множественное цитирование

Да, конечно, эти праймеры НЕ диагностические, ессно, только для синтеза генов. HaeI и BalI - не введеные, случайно возникли. Продукт получали без лигирования, чисто реакция in vitro, причем перекрытие было не 100%, а 55С smile.gif , т.е. в зависимости от состава олигов, а длину праймеров делал не более 50 нуклеотидов (боялся мутаций именно при синтезе олигов). Ну и, конечно, в первом и последнем олиге - введеные сайты рестрикции. В нашем случае - HindIII и XhoI.
Мне, например, было бы крайне интересно пообщаться с народом, у кого есть опыт синтеза ДНК при помощи PCR...
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 20.07.2004 12:32     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #37 множественное цитирование

Опыт есть, но, к сожалению, небольшой. Довелось как-то кроить составной ген из 5 разных кусочков. Синтезировать было слишком накладно, поэтому делали ампликоны асимметричной ПЦР, полученные однонитевые мегапраймеры сливали попарно и размножали обычной ПЦР. Хитрость здесь заключается в том, что при повторных амплификациях начинает вылезать шмер, поэтому нужно амплифицировать короткими циклами. Ещё лучше - вместо Taq брать KlenTaq. Он шмерит намного меньше. Еще один важный нюанс: Taq даёт ампликоны с выступающим избыточным А на 3'-конце. Т.е. при подборе праймеров нужно учитывать, что перед 5'-концем должен стоять T.
Участник оффлайн! alex2345
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 20.07.2004 12:39     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #38 множественное цитирование

Автор - Вешка:


80-150 bp это вообще не вопрос - праймеры можно делать вкривь и вкось - всё равно получится   smile.gif  
Про димеры ещё раз. ЭТО ЛЕГКО. Шпильки??? Наплюйте. Из опыта.
А в чём проблема уникальности 5'-конца???
....

Не 5', а 3' конца. Праймер отжигается прежде всего своим 3' концом. Одно дело, когда ты работаешь с одним или несколькими клонами, другое дело, если у тебя cDNA pool из тканей, например, человека.

Это из серии "я ему про Фому, а он мне про Ерёму". Сам же сказал:

"ДРУГОЕ ДЕЛО если Вы хотите чтобы это всё работало в quantitative...

Ты работал с QPCR? Наплюёшь на вторичные структуры - получишь болт, а не количественный анализ.
Участник оффлайн! the stranger
Участник



 прочитанное сообщение 20.07.2004 12:57     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #39 множественное цитирование

А что такое диагностический праймер? Уж извините за глупый вопрос. Это тот, что применяется в ПЦР-диагностике?
И еще хотел бы вернуть дискуссию в нужное русло о программах, а не о структуре праймеров: для ПЦР-диагностики какой программой лучше подбирать? Ведь там надо еще проверять специфичность праймеров. Это делают в Blast'е что ли?
Участник оффлайн! Павел
Постоянный участник
Новосибирск



 прочитанное сообщение 20.07.2004 13:08     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #40 множественное цитирование

Автор - genseq:
........., поэтому делали ампликоны асимметричной ПЦР, полученные однонитевые мегапраймеры сливали попарно и размножали обычной ПЦР. ......
.... Taq даёт ампликоны с выступающим избыточным А на 3'-конце. Т.е. при подборе праймеров нужно учитывать, что перед 5'-концем должен стоять T.
интересно, интересно smile.gif , Я не использовал ассиметричную PCR, работает и так, просто внутренние олиги беру в несколько раз меньшей концентрации (эмпирически), внешние - нормально, примерно по 40pM в реакцию.
Да и еще. Выступающий А не так страшен. Я одно время его учитывал, потом бросил - т.к. это еще одно ограничение по праймерам. Структура то гена задана довольно жестко, в частности, частота использвания кодонов - вещь оч.важная. Тем более, что сиквенс продуктов реакции не показал удручающих результатов именно по этому злополучному А.


Автор - the stranger:
А что такое диагностический праймер? Уж извините за глупый вопрос. Это тот, что применяется в ПЦР-диагностике?
И еще хотел бы вернуть дискуссию в нужное русло о программах, а не о структуре праймеров: для ПЦР-диагностики какой программой лучше подбирать? Ведь там надо еще проверять специфичность праймеров. Это делают в Blast'е что ли?
да, диагностический - для подтвержения, что искомый ген есть в пробирке smile.gif . Мы тут болтает о БЕЗМАТРИЧНОМ синтезе ДНК, вы уж извините...
А специфичность праймеров можно смотреть по-разному. Сами программки это учитывают, я пользую чаще всего OLIGO, реже - VectorNTI, иногда и то, и другое.. Главное- нАчать, а там сами разберетесь wink.gif
Участник оффлайн! alex2345
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 20.07.2004 13:27     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #41 множественное цитирование

To Павел:

> примерно по 40pM в реакцию...

Хочу уточнить, что 40 pmol, а вот если M большое, то тогда приставка µ получается.

> я пользую чаще всего OLIGO, реже - VectorNTI

Я бы порекомендовал модуль DNAStar - PrimerSelect.
Можно поучаствовать самому в дизайне: показывает налету все погрешности.
Участник оффлайн! Павел
Постоянный участник
Новосибирск



 прочитанное сообщение 20.07.2004 13:39     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #42 множественное цитирование

shuffle.gif да, конечно, сорри, именно 40pmol
а этот софт еще не смотрел, будет время - потыкаюсь мышом. К любой программе надо привыкнуть, прочувствовать...
К OLIGO с детства привык smile.gif , а Vector тем хорош, что все под рукой: и база данных, и олиги, и белки и т.п. удобно, и графика на высоте. Я за него голосую всеми лапками!
Участник оффлайн! the stranger
Участник



 прочитанное сообщение 20.07.2004 13:55     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #43 множественное цитирование

А где взять oligo или PrimerSelect вместе с DNAStar?
Участник оффлайн! Павел
Постоянный участник
Новосибирск



 прочитанное сообщение 20.07.2004 14:25     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #44 множественное цитирование

ну попросите у народа, или поиском по форуму поищите.
OLIGO могу дать smile.gif
Участник оффлайн! the stranger
Участник



 прочитанное сообщение 20.07.2004 14:29     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #45 множественное цитирование

Отлично, пришлите на адрес kvom(nospam)@mail.ru
Участник оффлайн! Павел
Постоянный участник
Новосибирск



 прочитанное сообщение 20.07.2004 15:04     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #46 множественное цитирование

check your e-mail
Участник оффлайн! Veshka
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 20.07.2004 16:45     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #47 множественное цитирование

Во-первых, я опечатался, конечно. Во вторых,из десятков кДНКовых PCRoв хоть мультиплексных, хоть моноплексных у меня в хдшем случае вылазили сплайсварианты. Ну, вылезет когда-нибудь что-то едва различимое, иногда оно же в виде забора, но никогда не мешало...

Это из серии "я ему про Фому, а он мне про Ерёму". Сам же сказал:

Ты работал с QPCR? Наплюёшь на вторичные структуры - получишь болт, а не количественный анализ.

Ага, на тубике, на риал-тайме. Болт получается вне зависимости от шпилек - там всё шпильки smile.gif Но работать можно smile.gif

И вообще я своего мнения не навязываю. Как хотите, так и делайте, убивайтесь о кривые GUI до морковкиного заговения.
Участник оффлайн! Veshka
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 20.07.2004 16:54     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #48 множественное цитирование

Автор - genseq:
Опыт есть, но, к сожалению, небольшой. Довелось как-то кроить составной ген из 5 разных кусочков. Синтезировать было слишком накладно, поэтому делали ампликоны асимметричной ПЦР, полученные однонитевые мегапраймеры сливали попарно и размножали обычной ПЦР. Хитрость здесь заключается в том, что при повторных амплификациях начинает вылезать шмер, поэтому нужно амплифицировать короткими циклами. Ещё лучше - вместо Taq брать KlenTaq. Он шмерит намного меньше. Еще один важный нюанс: Taq даёт ампликоны с выступающим избыточным А на 3'-конце. Т.е. при подборе праймеров нужно учитывать, что перед 5'-концем должен стоять T.
Во гимор...на таке ген собирать... Чтобы не шмерило, нужно просто днтп, праймеры и полимеразку вниз загнуть. А мегапраймерные методы - вообще полный люэс. Если уж мегапраймерами баловАться, надо не ассимметричный делать, а биотин 5'-концевой. И кто мешал продукт отжига с коротких праймеров в Н.У. амплифицировать? И как это Вы учитывали внематочные А, когда они не в рамке получатся - вообще убей Бог не пойму... lol.gif
Участник оффлайн! Carbon Copy
Постоянный участник
So close no matter how far



 прочитанное сообщение 20.07.2004 18:20     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #49 множественное цитирование

...Taq даёт ампликоны с выступающим избыточным А на 3'-конце. Т.е. при подборе праймеров нужно учитывать, что перед 5'-концем должен стоять T.
...Чтобы не шмерило, нужно просто днтп, праймеры и полимеразку вниз загнуть.
Да нет, ни первое и не второе. Вместо Taq нужно использовать любую другую полимеразу, у которой нет terminal transferase activity, например - Pfu, дающую blunt ends.
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 20.07.2004 19:21     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #50 множественное цитирование

To: Veshka

"Во гимор...на таке ген собирать..."
Если я правильно понял, то "гимор" - это, по-видимому, геморрой, а "так" - это Taq-полимераза. Собирать на "таке" гены - это "гимор" только для начинающих генных инженеров, а я этим делом балуюсь с 75 года прошлого века.

"Чтобы не шмерило, нужно просто днтп, праймеры и полимеразку вниз загнуть."
KlenTag стоит использовать для устранения шмера только в том случае, если снижение количества Taq не помогает. "Загибать" ещё и дНТФ с праймерами нет ни какого смысла.

"А мегапраймерные методы - вообще полный люэс."
С этим заболеванием пока не сталкивался.

"Если уж мегапраймерами баловАться, надо не ассимметричный делать, а биотин 5'-концевой."
Кажется, что-то умное, но не пойму, что именно. Нельзя ли поподробнее?

"И кто мешал продукт отжига с коротких праймеров в Н.У. амплифицировать?"
Знать бы ещё, что такое "Н.У.".

"И как это Вы учитывали внематочные А, когда они не в рамке получатся - вообще убей Бог не пойму... "
Первые несколько лет было тяжело, а потом привык. Если помучаетесь столько же, то поймёте.

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Софт · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 29.03.24 02:46
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft