Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
the stranger Участник |
|
genseq Постоянный участник |
|
AlexRider |
|
lokh Участник |
tam i dlia TaqMan udobno |
Esya Постоянный участник PA, USA |
Автор - AlexRider: Так их головой подбирают, а не только программой.
Успешно работаем с GeneRunner (он freeware в сети). С подобранными им праймерами не было ни одного прокола. |
lokh Участник |
|
DmitriM Постоянный участник |
Лично я пльзуюсь Primer3 и никогда по вине праймеров неудач не имел. |
Петровичъ Постоянный участник |
|
Veshka Постоянный участник Москва |
|
genseq Постоянный участник |
1. Как подбирать праймеры? 2. По какой последовательности их подбирать. Знатоков много, но у каждого свои воззрения. Одни советуют на 3'-конец ставить G, другие утверждают, что это противопоказано. В Oligo тугоплавкие 3'-концы отбраковываются, тогда как в литературе полно этого "брака". Так что по первой проблеме хотелось бы подискутировать. Что касается второй (выбор последовательности), то тут тоже всё не так-то просто. В GenBank полно близких последовательностей и их можно легко перепутать - взять не тот штамм или мутантный вариант, отличающийся от имеющейся матрицы. Например, вирусы, особенно РНКовые, чрезвычайно вариабельны. Мне доводилось рассчитывать праймеры на ГЛПС, герпесную группу, онкогенные типы HPV, SARS и многие другие возбудители. Часто задачки оказывались головоломными, но вполне разрешимыми. Давно подбираюсь к HIV, но даже боюсь начинать. Эта головоломка, похоже, слишком сложна. Какие есть мнения по этому поводу? |
AlexRider |
[/quote]Так их головой подбирают, а не только программой. [/QB][/QUOTE] Дык голова вместе с серыми клеточками к компутеру по дефолту прилагается в большинстве случаев. |
yack Постоянный участник Москва, Россия |
|
Veshka Постоянный участник Москва |
|
a26 Постоянный участник |
|
Veshka Постоянный участник Москва |
1. Вредно не G на праймере, а G после праймера. Но вообще пиримидины в праймерах рулят 2. Состав конца сложный вопрос. Лучше всего что-нибудь типа SWWWSSWT или SWSWWSWC 3. Праймеры <19 при GС<60% - suxxx. И не спрашивайте, почему. Эмпириццки. Оптимальная длина при средней температуре по больнице -22-23. 4. Стретчи одной буквы - главный враг писиарщика. |
genseq Постоянный участник |
Автор - Veshka: Узнать бы ещё, что такое "тубик" . Да и про аллели у HIV желательно поподробнее .
Ничего головоломного в хиве особо нет. Попробуйте тубик, аллель-специфические |
genseq Постоянный участник |
Автор - Veshka: 1. Про G после праймера непонятно. И как рулят пиримидины? Если имеется в виду "rules", то пурины предпочтительнее. По вкладу в специфичность: A>G>C>T. Есть другие мнения?1. Вредно не G на праймере, а G после праймера. Но вообще пиримидины в праймерах рулят 2. Состав конца сложный вопрос. Лучше всего что-нибудь типа SWWWSSWT или SWSWWSWC 3. Праймеры <19 при GС<60% - suxxx. И не спрашивайте, почему. Эмпириццки. Оптимальная длина при средней температуре по больнице -22-23. 4. Стретчи одной буквы - главный враг писиарщика. 2. Состав 3'-конца с учётом только S или W выбирать нельзя. 3. Не спрашиваю, почему suxxx. Но что такое suxxx? Длина (при нынешней дешевизне синтеза) зависит от задачи, но, как правило, зашкаливает за 30N, а "температура по больнице" - за 60. 4. Стретчи (повторы) вредны, но только на 3'-конце. Главные враги - внутрипраймерные и межпраймерные залипания (особый случай - димеры), а также внутрипраймерные и межпраймерные (ампликонные) тугоплавкие шпильки. Есть другие мнения? |
gostya Постоянный участник |
другие мнения... имхо, если структура верна, праймеры так или иначе работают, программы помогают оптимизировать процесс, праймеры короткие и низкотемпературные хорошо для сиквенса, праймеры длинные хорошо для ПЦР, праймеры не работают, если структуру в GenBank послал какой-то идиот, а Вы на нее купились |
genseq Постоянный участник |
А за словарик спасибо. |
Veshka Постоянный участник Москва |
"Мозес Аронович не свинья ??? Ну, Вы меня извините!!!" (с) Исаак Моисеевич Тубик - это, блин, тубик. Те, кто с его GC составом один раз поцеловался, больше его болезного (самого, кстати, болезного по данным ВОЗ) не забудут никогда 2Gostya. Вообще работает всё, в определённых условиях, но Вам никогда не приходилось видеть, как легкоплавкие праймеры отжигаются на левое место даже при завышенной (для них) температуре? Это Вы с GC мало возились... Почему пиримидины лучше? А фиг его знает... Я же сказал, что как сороконожка буду. Накопленные и не систематизированные эмпирические данные. По Г... была какая-то ссылка по элонгации через это Г... я посмотрел - воспроизводится, даже без риал-тайма видать. А что касается преимущественной элонгации, то это вы, Генсек, просто статей мало читали, потому так уверенно пурины и пиримидины в три шеренги на подоконнике строите... |
gostya Постоянный участник |
это при ПЦРе? почему спрашиваю, потому что, например, при сиквенсе отжиг ведут при 37, так что там длинные праймеры и без GC отжигаются где попало, ну а уж GC сиквенировать этим пусть мазохисты занимаются, извините |
Veshka Постоянный участник Москва |
А зачем это сиквенс при 37 отжигать? Вроде все как бы термосеквеназой и производными от неё пользуются... К вопросу о том, как размножаются ёж...извините отжигаются праймеры, я бы посоветовал (это я Вам, Генсек, эксклюзив, можно сказать) сконструировать non-redundant панельку праймеров под...мнэээ лидеры тяжёлых цепей антител человека длиной эдак в 18-22, а потом изучить на этом показательном примере поведение некомплементарных 3'-концов. Может быть тогда вопросы о тм где и чего в праймерах важнО отпадут сами. |
gostya Постоянный участник |
|
Veshka Постоянный участник Москва |
Нафига? Подбор вручную труден первый год, потом это занимает меньше времени, чем жать на какие-то-там-кнопки в программе, которые обычно бывают с хреноватейшим GUI |
alex2345 Постоянный участник |
Я подбираю вручную только для сиквенса и обычного PCR. Хотя если хочется баз проколов, то больше доверяю программе. А подобрать хорошую пару праймеров для QPCR вручную считаю вообще невозможным. Если вы вручную просчитываете такие параметры как: 3' Pentamer Stability Overall Stability Unique 3' Sequence of 7 bp <= 2 bp Dimer Duplexing <= 2 bp Hairpin Duplexing, то снимаю перед вами шляпу. |
Veshka Постоянный участник Москва |
Запросто. Игрушки с праймер-директед мутациями показывают, что имеет смысл тример stability, не более, если праймер нормальный в целом. Overall Stability элементарно Unique 3' Sequence of 7 bp это что значит? если чтобы внутренних отжигов не было, так это опять же игра не на том. эта характеристика ИМХО вредная <= 2 bp Dimer Duplexing <= 2 bp Hairpin Duplexing, а это что значит?8-/? праймер димеров вручную избежать тоже элементарно. Для справки. Один мой знакомый написал в МатЛабе прогу для отлова димеров от 3 до скольки-то с конца включая неполные и прогнал мой сет антительных праймеров что-то штук сорок. Был найден один проблемный вариант, изведён в три буквы что ли... по-моему это всё вопрос практики...но если праймеры делать раз в год, может луЧЧе и софтом, а лучше пусть тогда кто-то ещё делает... |
Fedo Постоянный участник Nemetchina |
|
alex2345 Постоянный участник |
Элементарно и запросто - не катит. Даются последовательности - 10 штук размером 3-4 кб. Требуется пара праймеров с минимальным отличием в Tm без образования (т.е. меньше-равно 2 bp) димеров и hairpin структур. Размер амплифицированного продукта - 80-150 bp. Праймер должен быть уникален как минимум 7 bp на 3ь-конце , т.к. амплифицируется cDNA pool. |
Veshka Постоянный участник Москва |
80-150 bp это вообще не вопрос - праймеры можно делать вкривь и вкось - всё равно получится Про димеры ещё раз. ЭТО ЛЕГКО. Шпильки??? Наплюйте. Из опыта. А в чём проблема уникальности 5'-конца??? По-моему задачка, которую приводил я сложнее - выдернуть "правильное" антитело используя ОДНОВРЕМЕННО праймеры для лидеров (18-24 штука) чтобы не уродовать истинный N-конец. Посмотрите на эти лидеры на досуге - поймёте, почему ДРУГОЕ ДЕЛО если Вы хотите чтобы это всё работало в quantitative... Но там в первую очередь всё будет сильно зависеть состава матриц - я бы их нормализировал сначала ghjcnj сибром, сли они различаются по GC а для этого программы тоже не нужны... |
|
http://www.idtdna.com/SciTools/SciTools.aspx or: http://www.invitrogen.com/content.cfm?pageid=9716 |
|
[Текст переведён с транслита] |
genseq Постоянный участник |
1. Легкоплавкость 3’-концов (ΔG не ниже –9,0). Это снижает фон неспецифических реакций. 2. Повышенное содержание пуриновых оснований (A и G) на 3’-концах. Это также влияет на их специфичность. 3. Минимизирована вероятность межпраймерных и внутрипрайменых взаимодействий (введены корректирующие замены, устраняющие межпраймерные взаимодействия и нежелательное формирование шпилечных структур). 4. Температуры плавления всех праймеров превышают 65° и в большинстве случаев составляют около 70°. 5. В некоторые праймеры введены 5’-концевые нуклеотидные замены, повышающие их Tm. 6. Праймеры не формируют шпилек с Tm более 30°. 7. Комплементарные праймерам участки анализируемой ДНК не участвуют в формировании тугоплавких шпилек. 8. Межпраймерные участки ампликонов не содержат тугоплавких шпилечных структур, затрудняющих полимеразную реакцию. Интересно было бы узнать, действительно ли G рядом с праймером может влиять на инициацию? Может быть, праймер в экспериментах "сороконожки" просто частично накладывался на тугоплавкую матричную шпильку (см. п.7)? И ещё. Очень не рекомендую праймеры с повышенным содержанием пиримидинов (особенно T) на 3'-конце. На этом я уже обжигался. Хорошо бы узнать, кто ещё обжигался, и на чём именно. Хорошая ошибка может оказаться полезнее множества безошибочных опытов. |
Павел Постоянный участник Новосибирск |
Вот такой структуры: CTGGCCAAGAAGATCCTGAAGGAGCCCGTGCACGGCGTGGCCGACTCCGG один из его "димеров" имел энергию образования -18,1 kkal/mol. О как! Заменой всего одного нуклеотида (молчащая мутация Pro->Pro) CTGGCCAAGAAGATCCTGAAGGAGCCTGTGCACGGCGTGGCCGACTCCGG удалось снизить энергию до -4.8 kkal/mol. И все получилось. Ох, и достал он меня, этот ген!!!!! |
genseq Постоянный участник |
Кстати, Вы собирали ген из коротких ампликонов сплайсингом in vitro, через сайты рестрикции (на 5'-конце есть HaeI или BalI) или просто лигировали олиги? |
Павел Постоянный участник Новосибирск |
Мне, например, было бы крайне интересно пообщаться с народом, у кого есть опыт синтеза ДНК при помощи PCR... |
genseq Постоянный участник |
|
alex2345 Постоянный участник |
Автор - Вешка: Не 5', а 3' конца. Праймер отжигается прежде всего своим 3' концом. Одно дело, когда ты работаешь с одним или несколькими клонами, другое дело, если у тебя cDNA pool из тканей, например, человека. 80-150 bp это вообще не вопрос - праймеры можно делать вкривь и вкось - всё равно получится Про димеры ещё раз. ЭТО ЛЕГКО. Шпильки??? Наплюйте. Из опыта. А в чём проблема уникальности 5'-конца??? .... Это из серии "я ему про Фому, а он мне про Ерёму". Сам же сказал: "ДРУГОЕ ДЕЛО если Вы хотите чтобы это всё работало в quantitative... Ты работал с QPCR? Наплюёшь на вторичные структуры - получишь болт, а не количественный анализ. |
the stranger Участник |
И еще хотел бы вернуть дискуссию в нужное русло о программах, а не о структуре праймеров: для ПЦР-диагностики какой программой лучше подбирать? Ведь там надо еще проверять специфичность праймеров. Это делают в Blast'е что ли? |
Павел Постоянный участник Новосибирск |
Автор - genseq: интересно, интересно , Я не использовал ассиметричную PCR, работает и так, просто внутренние олиги беру в несколько раз меньшей концентрации (эмпирически), внешние - нормально, примерно по 40pM в реакцию.........., поэтому делали ампликоны асимметричной ПЦР, полученные однонитевые мегапраймеры сливали попарно и размножали обычной ПЦР. ...... .... Taq даёт ампликоны с выступающим избыточным А на 3'-конце. Т.е. при подборе праймеров нужно учитывать, что перед 5'-концем должен стоять T. Да и еще. Выступающий А не так страшен. Я одно время его учитывал, потом бросил - т.к. это еще одно ограничение по праймерам. Структура то гена задана довольно жестко, в частности, частота использвания кодонов - вещь оч.важная. Тем более, что сиквенс продуктов реакции не показал удручающих результатов именно по этому злополучному А. Автор - the stranger: да, диагностический - для подтвержения, что искомый ген есть в пробирке . Мы тут болтает о БЕЗМАТРИЧНОМ синтезе ДНК, вы уж извините...А что такое диагностический праймер? Уж извините за глупый вопрос. Это тот, что применяется в ПЦР-диагностике? И еще хотел бы вернуть дискуссию в нужное русло о программах, а не о структуре праймеров: для ПЦР-диагностики какой программой лучше подбирать? Ведь там надо еще проверять специфичность праймеров. Это делают в Blast'е что ли? А специфичность праймеров можно смотреть по-разному. Сами программки это учитывают, я пользую чаще всего OLIGO, реже - VectorNTI, иногда и то, и другое.. Главное- нАчать, а там сами разберетесь |
alex2345 Постоянный участник |
> примерно по 40pM в реакцию... Хочу уточнить, что 40 pmol, а вот если M большое, то тогда приставка µ получается. > я пользую чаще всего OLIGO, реже - VectorNTI Я бы порекомендовал модуль DNAStar - PrimerSelect. Можно поучаствовать самому в дизайне: показывает налету все погрешности. |
Павел Постоянный участник Новосибирск |
а этот софт еще не смотрел, будет время - потыкаюсь мышом. К любой программе надо привыкнуть, прочувствовать... К OLIGO с детства привык , а Vector тем хорош, что все под рукой: и база данных, и олиги, и белки и т.п. удобно, и графика на высоте. Я за него голосую всеми лапками! |
the stranger Участник |
|
Павел Постоянный участник Новосибирск |
OLIGO могу дать |
the stranger Участник |
|
Павел Постоянный участник Новосибирск |
|
Veshka Постоянный участник Москва |
Это из серии "я ему про Фому, а он мне про Ерёму". Сам же сказал: Ты работал с QPCR? Наплюёшь на вторичные структуры - получишь болт, а не количественный анализ. Ага, на тубике, на риал-тайме. Болт получается вне зависимости от шпилек - там всё шпильки Но работать можно И вообще я своего мнения не навязываю. Как хотите, так и делайте, убивайтесь о кривые GUI до морковкиного заговения. |
Veshka Постоянный участник Москва |
Автор - genseq: Во гимор...на таке ген собирать... Чтобы не шмерило, нужно просто днтп, праймеры и полимеразку вниз загнуть. А мегапраймерные методы - вообще полный люэс. Если уж мегапраймерами баловАться, надо не ассимметричный делать, а биотин 5'-концевой. И кто мешал продукт отжига с коротких праймеров в Н.У. амплифицировать? И как это Вы учитывали внематочные А, когда они не в рамке получатся - вообще убей Бог не пойму...
Опыт есть, но, к сожалению, небольшой. Довелось как-то кроить составной ген из 5 разных кусочков. Синтезировать было слишком накладно, поэтому делали ампликоны асимметричной ПЦР, полученные однонитевые мегапраймеры сливали попарно и размножали обычной ПЦР. Хитрость здесь заключается в том, что при повторных амплификациях начинает вылезать шмер, поэтому нужно амплифицировать короткими циклами. Ещё лучше - вместо Taq брать KlenTaq. Он шмерит намного меньше. Еще один важный нюанс: Taq даёт ампликоны с выступающим избыточным А на 3'-конце. Т.е. при подборе праймеров нужно учитывать, что перед 5'-концем должен стоять T. |
Carbon Copy Постоянный участник So close no matter how far |
...Taq даёт ампликоны с выступающим избыточным А на 3'-конце. Т.е. при подборе праймеров нужно учитывать, что перед 5'-концем должен стоять T. ...Чтобы не шмерило, нужно просто днтп, праймеры и полимеразку вниз загнуть. Да нет, ни первое и не второе. Вместо Taq нужно использовать любую другую полимеразу, у которой нет terminal transferase activity, например - Pfu, дающую blunt ends.
|
genseq Постоянный участник |
"Во гимор...на таке ген собирать..." Если я правильно понял, то "гимор" - это, по-видимому, геморрой, а "так" - это Taq-полимераза. Собирать на "таке" гены - это "гимор" только для начинающих генных инженеров, а я этим делом балуюсь с 75 года прошлого века. "Чтобы не шмерило, нужно просто днтп, праймеры и полимеразку вниз загнуть." KlenTag стоит использовать для устранения шмера только в том случае, если снижение количества Taq не помогает. "Загибать" ещё и дНТФ с праймерами нет ни какого смысла. "А мегапраймерные методы - вообще полный люэс." С этим заболеванием пока не сталкивался. "Если уж мегапраймерами баловАться, надо не ассимметричный делать, а биотин 5'-концевой." Кажется, что-то умное, но не пойму, что именно. Нельзя ли поподробнее? "И кто мешал продукт отжига с коротких праймеров в Н.У. амплифицировать?" Знать бы ещё, что такое "Н.У.". "И как это Вы учитывали внематочные А, когда они не в рамке получатся - вообще убей Бог не пойму... " Первые несколько лет было тяжело, а потом привык. Если помучаетесь столько же, то поймёте. |
« Предыдущая тема · Софт · Следующая тема » |