Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Neimrut |
Стоит следующая задача: выделить и охарактеризовать компоненты (субъединицы) рецепторного комплекса. Для этой цели запланирована следующая последовательность действий: - растятся клетки, отвечающие на лиганд к искомому рецепторному комплексу; - в среду вносится лиганд; - после некоторой экспозиции вносится водорастворимый белковый кросслинкер, ковалентно сшивающий сближенные белки; - после еще одной экспозиции вносится модифицированный биотин, конъюгированный с пероксидазой; - собирается мембранная фракция; - проводится иммунопреципитация на антитело к лиганду всего рецепторного комплекса (и всех соседей по мембране, кому повезло оказаться ближе 12Å - длина кросслинкера); - преципитат разгоняется в электрофорезном геле, -S-S- связи в кросслинкере расщепляются; - добавляется хромогенный субстрат пероксидазы, пришитой к биотину, которым были помечены все мембранные белки (альтернатива - кумасси, но я полагаю, с пероксидазой сигнал сильнее). Вопрос: существенно ли использование ингибиторов эндоцитоза, чтобы заблокировать уход рецептора с мембраны? Если да, то какой стоит использовать? Если работать с клетками на холоде - не помешает ли это сборке рецепторного комплекса (возможно, он собирается полностью после связывания с лигандом)? Литературных данных по скорости рециклинга для этого рецептора нет. Какие временные точки или длительность экспозиции после добавления лиганда советуете выбрать? Есть ли какие-то замечания к приведенной схеме? Я не являюсь специалистом в теме белок-белковых взаимодействий и очистки белка, поэтому любые уточнения приветствуются. И, пожалуйста, если будете отвечать, не спрашивайте меня, какой лиганд фигурирует в исследовании - это, скажем так, коммерческая тайна; заранее приношу извинения. Небольшая белковая молекула. Сообщение было отредактировано Neimrut - 10.10.2018 16:22 |
MMM Постоянный участник |
Так это вам виднее некоторые рецепторы НЕ интернализуются некоторые интернализуется, а какой у вас кроме вас никому неведомо. --Если работать с клетками на холоде - не помешает ли это сборке рецепторного комплекса (возможно, он собирается полностью после связывания с лигандом)? А к чему этот вопрос? Вы ингибиторы используете и температуру понижаете..... ---Какие временные точки или длительность экспозиции после добавления лиганда советуете выбрать? Используйте литературные данные и подбирайте экспериментально. ---Есть ли какие-то замечания к приведенной схеме? Есть |
Neimrut |
(MMM @ 11.10.2018 00:11) --существенно ли использование ингибиторов эндоцитоза, чтобы заблокировать уход рецептора с мембраны? Так это вам виднее некоторые рецепторы НЕ интернализуются некоторые интернализуется, а какой у вас кроме вас никому неведомо. --Если работать с клетками на холоде - не помешает ли это сборке рецепторного комплекса (возможно, он собирается полностью после связывания с лигандом)? А к чему этот вопрос? Вы ингибиторы используете и температуру понижаете..... ---Какие временные точки или длительность экспозиции после добавления лиганда советуете выбрать? Используйте литературные данные и подбирайте экспериментально. ---Есть ли какие-то замечания к приведенной схеме? Есть Здравствуйте. Хотел поязвить про себя на счет содержательности ответа, но, видимо, это во многом моя вина - каков вопрос, таков ответ. Под отсутствием литературных данных о рециклинга я как раз имел имел в виду, что интернализуется или нет - неизвестно. Низкая температура фигурировала как альтернатива использованию химического ингибитора. Кажется рациональным проведение двух (серий) экспериментов, но средства пока исчерпаны, поэтому часть вопроса про ингибитор снимается. Остается вопрос про холод. По временным точкам - меня интересовали масштабы временных отрезков в подобных экспериментах. Условно, 5 минут - это много или мало для подобных процессов? Это вопрос для тех, кто изучал, хотя бы путем чтения, механизмы сборки мембранных рецепторных комплексов, инициируемые в присутствии лиганда. Сам я изучаю литературу по этому вопросу, но форум - экономия времени. По поводу замечаний, то если они у Вас есть, может быть Вы ими и поделитесь? Сообщение было отредактировано Neimrut - 11.10.2018 12:18 |
MMM Постоянный участник |
Так если неизвестно, то надо экспериментально это как-то проверить, хотя бы в микроскопе, тогда и с временными вещами что-то прояснится. --По временным точкам - меня интересовали масштабы временных отрезков в подобных экспериментах. Обычно там все разнится. В быстрых процессах все заканчивается за минуты, в медленных за десятки минут и в очень медленных(крайне редко) за часы. --после еще одной экспозиции вносится модифицированный биотин, конъюгированный с пероксидазой Че та совершенно непонятно, что там должна делать биотинилированная пероксидаза? --- собирается мембранная фракция; Это наверное для красоты? На кой ляд вам тратится на выделение мембран, если у вас иммунопреципитация. (Если вы думаете так избавится от свободного лиганда, то во первых он там ничему не мешает, а во вторых от него можно избавится просто промыв клетки перед лизисом.) -- добавляется хромогенный субстрат пероксидазы, пришитой к биотину, которым были помечены все мембранные белки Во-первых с какого рожна все мембранные белки пометились биотином? Во-вторых не встречал коньюгатов хромогенных субстратов с биотином, да еще таких, что бы они работали с пероксидазой. Ну совершенно непонятно каким боком здесь нужен этот самый экзотичный хромогенный биотин и почему это пероксидаза должна попасть в комплекс(причем в каждый его компонент) - раз. И не менее непонятно, как она будет работать после того, как ее сварили в буфере с SDS - два. |
Neimrut |
Выделение мембранной фракции проводилось в статьях на близкую тему. Я понимал это так, что авторы хотели снизить вероятность кросс-реакции антитела с белками из цитоплазмы, но зачем это делалось в точности указано не было. На счет активности пероксидазы после SDS-геля - это хорошо, что Вы указали, я действительно не подумал об этом. Вообще с биотином дело обстояло так: это не совсем биотин, это метка на основе конъюгата биотин-пероксидаза, спонтанно или в присутствии дополнительного реагента конъюгирующая в растворе с свободными аминогруппами или кето- и карбоксильными группами. Гидрофильная, позволяет метить трансмембранные протеины - по крайней мере должна метить все, у кого во внеклеточном домене в раствор экспонированы свободные реакционные группы. Задумка заключалась в том, что пероксидаза в сравнении с кумасси позволит значительно усилить чувствительность окрашивания после электрофореза за счет амплификации сигнала (но пришлось бы переносить белки из геля на подложку для WB). Есть основания думать, что рецептор экспрессируется не слишком обильно. Но с учётом того, что Вы сказали, видимо, стоит об этом забыть.) Что касается визуализации рецептора и наблюдения за его поведением - это было бы прекрасно, если бы можно было визуализировать его, не зная, из каких субъединиц он состоит. Именно поэтому мы собираемся использовать антитело к лиганду и линкер, который должен ковалентно пришить последний к рецептору. Сообщение было отредактировано Neimrut - 12.10.2018 00:16 |
MMM Постоянный участник |
У вас же антитела к лиганду? Лиганд сквозь мембрану сам по себе не проникает? Внутри в цитоплазме конститутивно не присутствует? Или как-то иначе? --Что касается визуализации рецептора и наблюдения за его поведением - это было бы прекрасно, если бы можно было визуализировать его, не зная, из каких субъединиц он состоит. Именно поэтому мы собираемся использовать антитело к лиганду и линкер, который должен ковалентно пришить последний к рецептору. Кто вам мешает использовать антитело к лиганду при иммунофлуоресценции(гистохимии). --Вообще с биотином дело обстояло так: это не совсем биотин, это метка на основе конъюгата биотин-пероксидаза, спонтанно или в присутствии дополнительного реагента конъюгирующая в растворе с свободными аминогруппами или кето- и карбоксильными группами. Вот зафига такой метке сдался биотин? Без него никак нельзя было соответствующую химию сделать? Дайте ссылку на этот изврат? В конце концов можно все пометить просто биотином. Он по-крайней мере при варке в SDS не умирает.И мол. вес изменяет на малую, но вполне понятную величину. В отличии от пероксидазы с непонятно каким углеводным компонентом и на порядки большим Мв. Биотином можно пометить и стрип после переноса белка на мембрану. Вообще цель то какая? На мембрану переносят, для того, что бы покрасить блот антителами. Т.е. обнаружить в комплексе предполагаемых участников. Если вам просто мол. массы определить, то вместо кумаси можно покрасить серебром или флуоресцентной краской прямо в геле В конце концов можно просто сшивку обратить восстановлением фосфинами, SH-группы кэпировать иодацетамидом. Затем все белки оттрипсинить и сдать на MALDI. Сообщение было отредактировано MMM - 12.10.2018 09:46
|
Neimrut |
(MMM @ 12.10.2018 06:53) У вас же антитела к лиганду? Лиганд сквозь мембрану сам по себе не проникает? Внутри в цитоплазме конститутивно не присутствует? Или как-то иначе? --Что касается визуализации рецептора и наблюдения за его поведением - это было бы прекрасно, если бы можно было визуализировать его, не зная, из каких субъединиц он состоит. Именно поэтому мы собираемся использовать антитело к лиганду и линкер, который должен ковалентно пришить последний к рецептору. Кто вам мешает использовать антитело к лиганду при иммунофлуоресценции(гистохимии). --Вообще с биотином дело обстояло так: это не совсем биотин, это метка на основе конъюгата биотин-пероксидаза. Вот зафига такой метке сдался биотин? Без него никак нельзя было соответствующую химию сделать? Дайте ссылку на этот изврат? В конце концов можно все пометить просто биотином. Он по-крайней мере при варке в SDS не умирает.И мол. вес изменяет на малую, но вполне понятную величину. В отличии от пероксидазы с непонятно каким углеводным компонентом и на порядки большим Мв. Биотином можно пометить и стрип после переноса белка на мембрану. Вообще цель то какая? На мембрану переносят, для того, что бы покрасить блот антителами. Т.е. обнаружить в комплексе предполагаемых участников. Если вам просто мол. массы определить, то вместо кумаси можно покрасить серебром или флуоресцентной краской прямо в геле В конце концов можно просто сшивку обратить восстановлением фосфинами, SH-группы кэпировать иодацетамидом. Затем все белки оттрипсинить и сдать на MALDI. Я пропущу пока момент с визуализацией. Давайте уже разберёмся с биотином! Реагент: Я на самом деле уже понял, благодаря Вашим комментариям, что выбор этого компонента был ошибкой. Моя мысль заключалась в том, чтобы на форезе иммунопреципитата, в котором каждый белок будет помечен этой меткой, проверить чувствительность кумасси. Перенос на мембрану из геля мне понадобился затем, чтобы хромогенный субстрат пероксидазы провзаимодействовал с ней. Неудачное решение, обусловленное тем, что я мало разбираюсь в методиках работы с белком.
Сейчас я выкинул биотиновый набор из плана закупки и поместил туда набор серебра. И спасибо Вам большое. С мембранной фракцией всё чуть менее однозначно. Я слышал, что при иммунопреципитации крупных белков (а в моём случае это должен быть перешитый мостиками рецепторный комплекс из нескольких субъединиц + лиганд) на них часто неспецифично налипают белки, функционально в комплексе не участвующие, или по крайней мере не относящиеся к его коровой части. Кроме того, если мы действительно будем использовать чувствительное окрашивание серебром, мне представлялось правильным по возможности избавиться от всех лишних фракций. Что Вы скажете? Сшивка. В качестве неё используем DTSSP. Насколько я понимаю, S-S связь должна развалиться в SDS сама, и все компоненты благополучно разбегутся. Или Вы предлагали обратить сшивку с биотином? Честно говоря, этот абзац не совсем понятен. Под обращением сшивки фосфином имелось в виду её расщипление или, наоборот, конъюгация? Что касается времяпролетной масс-спектроскопии, то Вы угадали, именно это должно быть конечным пунктом нашего исследования. Но у нам нет масс-спека. Может быть Вы знаете, кто занимается такими вещами, у кого есть опыт идентификации белков? Было бы просто здорово. |
MMM Постоянный участник |
Реагент: По этой ссылке пероксидазой и не пахнет. Это, можно сказать, стандартная биотиновая метка, не проникающая, на основе сульфогидроксисукцинимидного эфира. --Я слышал, что при иммунопреципитации крупных белков (а в моём случае это должен быть перешитый мостиками рецепторный комплекс из нескольких субъединиц + лиганд) на них часто неспецифично налипают белки, функционально в комплексе не участвующие, или по крайней мере не относящиеся к его коровой части. Для борьбы с этим явлением существуют многовсякие промывки преципитата. А так же контроли, например с сорбентом с неспецифичными АТ. --Сшивка. В качестве неё используем DTSSP. Насколько я понимаю, S-S связь должна развалиться в SDS сама, и все компоненты благополучно разбегутся. Не-а! Разрушающий S-S связи агент вовсе не SDS, а 2-меркаптоэтанол или DTT. Так же на всякий случай сообщу, что химические группы, атакуемые DTSSP и Sulfo-NHS-LC-Biotin одинаковы. --Под обращением сшивки "фосфином" имелось в виду её расщипление или, наоборот, конъюгация? Расщепление! фосфин это же конечно не PH3 - а это какой нибудь трифенилфосфин или(что лучше) трикарбоксиметил фосфин. --Что касается времяпролетной масс-спектроскопии, то Вы угадали, именно это должно быть конечным пунктом нашего исследования. Я не угадал, а просто, так как у вас комплекс явно ограниченный 10 белками(что не много), предложил воспользоваться так называемой Gel-free технологией. Когда вы сразу из преципитата делаете пробоподготовку на MALDI и анализируете все белки в пробе разом и сразу на MALDI. Но у нам нет масс-спека. Может быть Вы знаете, кто занимается такими вещами, у кого есть опыт идентификации белков? Было бы просто здорово. В Москве много мест. Вообще, можно тупо обратится в представительство например Brucker и спросить у кого стоят их белковые MALDI анализаторы и к дилерам так любимого вами TFS тоже с тем же вопросам, ну еще есть shimadzu. Сообщение было отредактировано MMM - 12.10.2018 19:57
|
Neimrut |
(MMM @ 12.10.2018 20:56) --Давайте уже разберёмся с биотином! Реагент: По этой ссылке пероксидазой и не пахнет. Это, можно сказать, стандартная биотиновая метка, не проникающая, на основе сульфогидроксисукцинимидного эфира. --Я слышал, что при иммунопреципитации крупных белков (а в моём случае это должен быть перешитый мостиками рецепторный комплекс из нескольких субъединиц + лиганд) на них часто неспецифично налипают белки, функционально в комплексе не участвующие, или по крайней мере не относящиеся к его коровой части. Для борьбы с этим явлением существуют многовсякие промывки преципитата. А так же контроли, например с сорбентом с неспецифичными АТ. --Сшивка. В качестве неё используем DTSSP. Насколько я понимаю, S-S связь должна развалиться в SDS сама, и все компоненты благополучно разбегутся. Не-а! Разрушающий S-S связи агент вовсе не SDS, а 2-меркаптоэтанол или DTT. Так же на всякий случай сообщу, что химические группы, атакуемые DTSSP и Sulfo-NHS-LC-Biotin одинаковы. --Под обращением сшивки "фосфином" имелось в виду её расщипление или, наоборот, конъюгация? Расщепление! фосфин это же конечно не PH3 - а это какой нибудь трифенилфосфин или(что лучше) трикарбоксиметил фосфин. --Что касается времяпролетной масс-спектроскопии, то Вы угадали, именно это должно быть конечным пунктом нашего исследования. Я не угадал, а просто, так как у вас комплекс явно ограниченный 10 белками(что не много), предложил воспользоваться так называемой Gel-free технологией. Когда вы сразу из преципитата делаете пробоподготовку на MALDI и анализируете все белки в пробе разом и сразу на MALDI. Но у нам нет масс-спека. Может быть Вы знаете, кто занимается такими вещами, у кого есть опыт идентификации белков? Было бы просто здорово. В Москве много мест. Вообще, можно тупо обратится в представительство например Brucker и спросить у кого стоят их белковые MALDI анализаторы и к дилерам так любимого вами TFS тоже с тем же вопросам, ну еще есть shimadzu. С пероксидазой я, конечно, дал маху . Судя по всему, в статье, которую проглядывал, использовали стрептавидин-биотиновый сендвич, и пероксидаза была на авидине. А я, увидев в названии реагента "EZ-Link", ничтоже сумняся расшифровал это как "энзим-сопряжённый". Что метка по ссылке будет конкурировать с кросслинкером, я понимал, и выше писал про аналогичную метку на -СOOH и -СО- группы.) Но после прокола с пероксидазой согласен, что резонно было ткнуть меня и в это.) Что касается контролей преципитата, то они, конечно, подразумевались, но я понял проблему так, что лишние белки могу за счет нековалентных белок-белковых взаимодействий налипать и на преципитированный белок интереса, а не только на сефарозу и Ab. Кроме того, я рассчитываю, что будет эксперимент по ко-иммунопреципитации, без кросслинкинга, на антитело к одному из предполагаемых компонентов комплекса - там не хотелось бы жестких промывок. С шивкой Вы меня запутали теперь ещё больше. Нам её убирать трикарбоксиметил фосфином, или достаточно расщипить линкер 2-меркаптоэтанолом? Если первое, то зачем? Отрегулировать молекулярный вес максимально близко к нативному? Я, конечно, надеюсь, что мои коллеги-молекулярщики разберутся с этим моментом, но раз уж я начал здесь, хочу довести обсуждение до конца. По поводу гель-фри подхода для MALDI - "а что, так можно было?". Больше, наверно, сказать нечего, протоколы наверняка можно найти или попросить у самих спектрометристов. Приоритетные дилеры Shimadzu, АНАЛИТ, кстати, недавно были у нас, но сказали, что их головная лаборатория в Питере такими вещами не занимается. Спасибо за подсказки, если через знакомых никого не найдём (мы сами не москвичи), попробуем так. Сообщение было отредактировано Neimrut - 13.10.2018 10:32 |
MMM Постоянный участник |
Я, конечно, надеюсь, что мои коллеги-молекулярщики разберутся с этим моментом, но раз уж я начал здесь, хочу довести обсуждение до конца. По поводу гель-фри подхода для MALDI - "а что, так можно было?". Больше, наверно, сказать нечего, протоколы наверняка можно найти или попросить у самих спектрометристов. Приоритетные дилеры Shimadzu, АНАЛИТ, кстати, недавно были у нас, но сказали, что их головная лаборатория в Питере такими вещами не занимается. Спасибо за подсказки, если через знакомых никого не найдём (мы сами не москвичи), попробуем так. Фосфиновые восстановители используются во многих MALDI пробоподготовках, Что бы экономить иодацетамид, которым кэпируют восстановленные SH связи белков. SH-реагенты менее удобны для этого, потому что берутся в избытке, который потом забирает на себя много иодацетамида. Для фореза достаточно SH-реагентики гельфри - да можно. У Аналит лаборатории может и нет, а приборы они продают, а кому продают им хорошо известно. |
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |