molbiol.ru -> PCR-клонирование

> Все форумы > Тематические форумы > Молекулярная и клеточная биология

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ

Правила FAQ* Поиск* Участники* Календарь* Избранные темы* Форум Форумов*

Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ]

Форум:

* PCR-клонирование

Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.

23.05.2001 12:41

URL #1

Кто-нибудь клонировал гены из бактерий спомощью PCR на лигазной смеси (лигируеш хромосому, по разным рестриктазам, в вектор и ставиш PCR на лигазной смеси с праймером на консервативный участок и со стандартным)?
Я таким образом вытащил N конец(из 5-ти рестриктаз 4 дали продукт, из них 2 -нужного размера), заказал на него праймер, и с этим праймером PCR не идет(только против консервативного), перепробовал 10 рестриктаз, и две мелкощепящие с недорестриктом - глухо.
Может у кого есть идеи по этому поводу, а то у меня творческий кризис.

23.05.2001 12:54

URL #2

Если можно, то поточнее исходные данные. Что это за консервативный участок?
З.Ы.А что, сиквенса данной бактерии не существует?

24.05.2001 13:55

URL #3

Сиквенса данной бактерии не существует, зато существуют сиквенсы этого гена из других бактерий (не помню точно, кажется штук шесть я нашел), они друг с другом почти не гомологичны, но есть небольшой гомологичный участок, названный мною, в предыдущем послании, "консервативным".

30.05.2001 14:15

URL #4

Ага, понятно.
Теперь дальше. Как я понял ты вытащил какой-то фрагмент из бактерии, отсеквенировал, заказал на него второй праймер и ПЦР не пошел?

31.05.2001 14:38

URL #5

Против первого праймера из этой бактерии он (PCR) идет, но он не идет против стандартного праймера на лигазной смеси.

01.06.2001 13:18

URL #6

Ну во-первых, это даже не совет, - поменять праймер или его направление.Если я все правильно понял, то картинка такая:
-> <-
====:------------------============---------
MCS N-unknown conserv. unknown
-> new primer
Дальше можно заказать праймеры направленные наружу от твоего секвенированого участка и ставить следующим образом: хромосому долбить рестриктазами, которых нет внутри, сильно разводить, кольцевать и ПЦР с этих праймеров.
Или еще вариант, сделать клонотеку и гибридизовать с фрагментом.

01.06.2001 13:22

URL #7

Тьфу, в картинке пробелы сожрались.

01.06.2001 13:51

URL #8

Не ясно насколько ты все правильно понял т. к. пробелы действительно сожрались.
Менять праймер не имеет смысла, поскольку он нормально отжигается (против 1-го), менять его ориентацию тем более не имеет смысла, поскольку праймер на N-конец направлен в сторону C-конца, если я поменяю ориентацию, будет PCR-ится область перед геном (а мне нужен ген).
Я пробова PCR-ить с двух, частично перекрывающихся праймеров в разные стороны на закольцованом рестрикте хромосомы - ничего не вышло ( к стати - зачем "сильно разводить"?).
Остается только гибридизовать, но очень не хочется (ни разу не делал, а пока метод поставиш куча времени уйдет, а тут лето).

01.06.2001 18:14

URL #9

"Сильно раззводить" - для того, чтоб при кольцевании у тебя не образовывались мультимеры, которые потом не амплифицируются.
Это кстати и вероятная причина неудач. Эту процедуру я провожу постоянно на разных колийных штаммах. Концентрация ДНК при этой процедуре должна быть ниже или равна 1 нг/мкл.
Рестриктазу нодо брать что-нибудь типа Sau3A. И ставить длинный ПЦР с хорошей длинной полимеразой.
(надеюсь, что у тебя частично перекрывающиеся праймеры не жгутся друг на друга).
Гибридизация штука несложная, но геморройная. Основная проблема в постановке ник-трансляции и доставании метки.