Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* CFSE staining -- ...если хочестя смотреть пролиферацию --
Компания Biocommerce - официальный дистрибьютер продукции компаний Miltenyi Biotec GmbH (Германия) и RanD S.r.l. (Италия).
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! Дядя ФАКСер
moderator
Nothern Maccaronia, Ticinum



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  08.02.2008 16:40     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  ICQ
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование
Важно!

скачать файл A_protocol_for_combining_proliferation_tetramer_staining_and_intracellular_cytokine_detection_for_the_flow_cytometric_analysis_of_antigen_specific_T_cells.pdf
размер: 179.94к
кол-во скачиваний: 7424




скачать файл LYMPHOCYTE_PROLIFERATION_USING_SUCCINIMIDYL_ESTER_OF_CARBOXYFLIORESCEIN_DIACETATE.pdf
размер: 389.44к
кол-во скачиваний: 1380




скачать файл CFSE_assay_lecture.PPT
размер: 762к
кол-во скачиваний: 53615




Всего благодарностей: 8Поблагодарили (8): Cheri, rediska, AE, gamma-delta, Libra, KYTX, Squaw, NBSC
Участник оффлайн! diesell

Москва



 прочитанное сообщение 26.02.2008 14:20     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  ICQ
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

Чертовски хотелось бы всё-таки...
Выложите еще раз, пожалуйста. shuffle.gif
Участник оффлайн! Дядя ФАКСер
moderator
Nothern Maccaronia, Ticinum



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  28.02.2008 16:34     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  ICQ
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

Done
guest: Василий
IP-штамп: fr7T68farXORs
гость



 прочитанное сообщение 11.02.2011 17:03     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

хочу поинтересоваться по поводу интерпретации результатов.
Насколько я понял, основная величина есть индекс пролиферации PI, который считается как отношение суммы событий в каждом поколении к сумме исходных родительских клеток (что есть остаток от деления числа событий в каждом поколении на 2 в степени, соответствующей номеру поколения).
НО возникает вопрос: в случае стимуляции лифоцитов антиген презентирующими клетками с костимуляционными молекулами, в пролиферацию уходят далеко не все лимфоциты, часть из них будет молчать, и будут сидеть в 1 пике наиболее интенсивно окрашенных CFSE. Отсюда возникает вопрос: считать надо вообще все клетки, меченые CFSE, или желательно вытащить активированные клетки? В принципе это не сложно с помощью антиCD25
А результаты будут совсем разными:
user posted image
(CFSE-FITC, CD45-VioBlue, CD25-APC)

Как правильнее поступить?
Участник оффлайн! Дядя ФАКСер
moderator
Nothern Maccaronia, Ticinum



 прочитанное сообщение 11.02.2011 17:26     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  ICQ
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

Наиболее корректно - это воспользоваться интерполяционной моделью для пиков по СFSE, для подсчета пролиферационного индекса. Подобные опции есть во FlowJo, к примеру.

Менее точный способ - сделать мультигейт (на гистограмме) по каждому из пиков и считать PI.

Кстати, подход с гейтингом по CD25 не особо хорош - после нескольких делений активационные маркеры частенько уходят в даун.

P.S. На дотплот CD45 vs CFSE и CD25 vs CFSE (gated on CD45+) можно взглянуть?

P.P.S. Кстати, последовательность логический гейтов на вышеприведенном примере не совсем корректна.
Следовалобы,сначала, сделать гейт по скаттером. а потом, уже из него - сабсеттинг и отсечку CFSE- и "хвостов".
Guest
IP-штамп: fr7T68farXORs
гость



 прочитанное сообщение 14.02.2011 18:01     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

Спасибо за помощь, сейчас более подробно опишу ситуацию.
По поводу FlowJo я знаю, вот только в данный момент нет средств приобрести данный софт, поэтому по мультигейтам буду считать. У меня проблема не столько в точности вычисления, сколько с определением тех клеток, которые надо считать smile.gif

По поводу эксперимента: сейчас все материалы и обсуждения по поводу обычного пролиферативного теста ( выделенные CD4+CD25- эффекторные клетки и CD3- антиген-презентирующие, орбработанные антибиотиком чтоб не росли)
Почему я решил сначала гейтировать CFSE-положительные события- потому как клетки, не меченые CFSE, дают нормальную такую кляксу на сайд/скаттер плоте, и мешают выделить пролиферирующие клетки. Хотя, по идее, при обратном порядке гейтирования результат чисто логически должен быть тот же...
user posted image

Вот плоты с гейтированием с сайд/скаттера. Видоно, что в гейте P2 помимо немеченных CFSE антиген-презентирующих клеток есть еще и часть меченных эффекторных, не прошедших ни одного деления. Значительная часть "молчащих" клеток сидит и в гейте P1, вот и думаю как их убрать(если вообще надо это делать)
user posted image
Guest
IP-штамп: frY1HAkYEwTNk
гость



 прочитанное сообщение 14.02.2011 23:20     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

Вот еще картинки

как я боролся с покоящимися клетками, гейтировав по CD45/CD25
user posted image

И вот вся схема поэтапного гейтирования ( здесь не изображен только 1 этап, когда я выбирал только FITC-положительный сигнал)
user posted image
Самое веселое- это то, что изначальная популяция эффекторных клеток была отсепарирована на магнитных частицах как CD4+CD25-, однако в каждой популяции кол-во CD25hi росло. Т.е. если условно разбить на субпопуляции по CD25neg, CD25dim и CD25hi, на последней гистограмме изображены распределения по CFSE для CD25hi(розовый график) CD25dim (оранжевый) и их сумма для всех CD25+ (синий)

Можно предположить, что CD25hi это какие-нить индуцированные из эффекторных Т-регуляторы, которые стремятся подавить пролиферацию активированных CD4-клеток (по крайней мере я собираюсь проверить это предположение, проверив культуру по foxp3) и мне кажется логичным считать именно CD25dim

Однако исходный вопрос все еще остается открытым: как мне считать PI? smile.gif)))))
Какие еще активационные маркеры стоит посмотреть? HLA-DR, CD45RO, CD127? Или забить и считать все CD4+?
Кто оценивал пролиферацию лимфоцитов вообще?
Участник оффлайн! Дядя ФАКСер
moderator
Nothern Maccaronia, Ticinum



 прочитанное сообщение 15.02.2011 12:22     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  ICQ
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

Ну так CD25 - это активационный маркер, и после стимуляции CD4+CD25+high- это не только Tregs. К тому же, хм...а где у вас сабсеттинг то лимфоцитов? Хот все отсортили, но для контроля стоит покрасить.
Foxp3 добавить бы (для точного отлова Treg). И Ki-67 - дабы поймать клетки в S-G2. и т.д.
Собственно,как раз активация-пролиферация T клеток-это то, чем я занимаюсь последние лет 8.
Какие у Вас ограничения по цветам (аппаратные,т.е.- что за цитометр)?
Участник оффлайн! Дядя ФАКСер
moderator
Nothern Maccaronia, Ticinum



 прочитанное сообщение 15.02.2011 12:26     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  ICQ
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

А PI считать для каждого из сабсетов-так будет корректнее.
Guest
IP-штамп: fr7T68farXORs
гость



 прочитанное сообщение 15.02.2011 13:05     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

Прибор MACSQuant от miltenyi, соответственно 3 лазера/7каналов, пока реально опыт работы с пятью цветами, плюс если очень надо можно предварительно отсепарировать образец на магнитной колонке.

Еще такой вопрос по поводу компенсации FITC/PE в случае CFSE: теоретически это возможно, на практике мне удается с трудом, м.б. слишком много добавляю CFSE? хотя клетки вроде не сильно дохнут и по прошествии 6 дней культивации без смены среды.

Foxp3 на неделе планирую посмотреть, как культура подрастет, но на руках у меня только anti-Foxp3-PE

Так же хочу узнать по поводу PECy5 канала, можно ли в теории скомпенировать его

По поводу CD25hi - меня смутило то, что 25hi-популяция реально выглядит как обособленная, у нее даже другие пики на гистограмме по FITC- немного сдвинутые вправо. Поэтому среди всех 25+ клеток (синяя гистограмма) даже просто посчитать кол-во генераций очень трудно.
Участник оффлайн! Дядя ФАКСер
moderator
Nothern Maccaronia, Ticinum



 прочитанное сообщение 15.02.2011 16:45     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  ICQ
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

1) CFSE-PE- да, без проблем. Просто СFSE надобно поменьше вначале,и вольтаж на FL1 уменьшить. Нужный стейнинг подбирается экспериментально.
2) PE-Cy5- без проблем (если тандем качественный). Не вижу никаких траблорв тут, ибо у Кванта полна матриа компенсаций. Вот с PE-Cy7 и PE-Cy5.5 в паре с PE были бы траблы ( жффективность энергопереноса у сих тандемов= хреновая, как уже неоднократно писал во многих темах, и они забивают PE-канал и по дурному лезут в красный)
3) Стимуляция сильная, бывает. Плюс, как понимаю- культура не особо синхронизированная. А пики сдвинуты в развертке FITC vs APC- ну так, компенсировать ручками, поиграться тоже.
Guest
IP-штамп: frY1HAkYEwTNk
гость



 прочитанное сообщение 18.02.2011 22:11     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

вот что получилось с флуорохромом PE:
user posted image

Vioblue-CD45, APC-CD4, PE-CD25

А Foxp3-PE не удается четко скомпенсировать, при увеличении напряжения на канале каша получается- из первого пика самых ярких по CFSE пробивается сигнал в канал PE, буду уменьшать кол-во добавляемого CFSE

>>как понимаю- культура не особо синхронизированная
не могли бы вы пояснить что вы имели ввиду, я пока что нуб в клеточных
технологиях smile.gif
Guest
IP-штамп: frDgDej8ywMnQ
гость



 прочитанное сообщение 16.07.2013 06:10     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

Мне кажется, что ваш Р2 гейтинг- это не только антигенпрезентирующие и эффекторные клетки , а apoptotic cells. Неплохо отдельно посмотреть на 7AAD (или PI) vs CFSE. Кстати, CD25-CD4+ в процессе культивирования- это мертвые CD4 T cells. Все живые приобретают CD25.

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Клеточные технологии · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 23.07.19 22:10
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft