molbiol.ru -> RAPD праймеры

> Все форумы > Тематические форумы > Молекулярная и клеточная биология

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ

Правила FAQ* Поиск* Участники* Календарь* Избранные темы* Форум Форумов*

Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ]

Форум:

* RAPD праймеры -- возможные структуры --

Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.

страницы (13): 1 2 3 > »

The problem
Постоянный участник

06.03.2013 09:09

URL #1

Обладает ли кто инфо по структурам праймеров для RAPD бактериальных геномов, принципы выбора, возможные структуры, ссылки для поиска

RNK
Постоянный участник
СССР

06.03.2013 09:42

URL #2

Мы можете сгенерировать 12-мерные случайные праймеры в программе FastPCR, то есть вначале сгенерировать случайную ДНК, а потом подобрать на ней 12-мерные случайные праймеры. Можно подобрать праймеры длиннее 12 оснований. Я могу вам выслать такие праймеры.

Другой вариант, это взять известный вам геном, например, ваши бактерии, и сделать анализ коротких последовательностей на частоту встречаемости. И использовать наиболее часто встречаемые последовательности как праймеры. Лучше использовать праймеры длиной в 12 оснований и выше. GC состав 50-60%, и без димеров. Это тоже очень просто сделать.

Затем просто надо проверить эти праймеры уже на практике, интересные или не интересные праймеры получились.

-Ъ-
Постоянный участник
Москва

06.03.2013 10:05

URL #3

3. Williams, J.G.K., Kubelik, A.R., Livak, K.J., Rafalski, J.A. and Tingey, S.V. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res., 18, 6531-6535, 1990.
4. Welsh, J. and McClelland, M. 1990. Fingerprint genomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acids Res., 18, 7213-7218.

История РАПД-ПЦР начиналась с них. Также что-то изображал в это же время Булат Сергей в Гатчине.
Неплохой обзор:
http://www.ipmd.ir/papers/random%20amplifi...polymorphic.pdf
Из личного опыта: праймеры могут быть любые! Но основное требование - отрицательный контроль должен быть чистым, без полос, при самых низких температурах отжига.
Успеха! Вот уж не ожидал что такой вопрос зададите.

Вы же кажется дифдисплеем занимались.

The problem
Постоянный участник

06.03.2013 10:29

URL #4

да, но дифф-дисплей а) был давно б) не предполагал рандома в) это была кДНК

-Ъ-
Постоянный участник
Москва

06.03.2013 10:41

URL #5

Простым РАПДом заниматься будет намного легче. Но все зависит от цели.
Одни и те же праймеры могут подходить к разным геномам, но, ессно, паттернами должны отличаться.
Как ни станно, требования к качеству ДНК высокие - сильно порванная ДНК имеет свои картинки по сравнению с высокомолекулярной.

The problem
Постоянный участник

06.03.2013 10:48

URL #6

идеологически так себе метод, особенно по нынешним временам

-Ъ-
Постоянный участник
Москва

06.03.2013 10:48

URL #7

(The problem @ 06.03.2013 11:29)

да, но дифф-дисплей а) был давно б) не предполагал рандома в) это была кДНК

РАПД приспособили к кДНК.
Welsh and McClelland, M. Fingerprinting using arbitrarily primed PCR: applications to genetic mapping, population biology, epidemiology and detection of differentially expressed RNAs. In: Mullis, K.B., Ferre, F. and Gibbs, R.A.
(eds.) The Polymerase Chain Reaction. pp. 295-303. Brikhauser, Boston, 1994.

Guest
IP-штамп: frQCpGSFifrEU
гость

06.03.2013 15:33

URL #8

Не надо трогать рапд. Вообще. Не надо даже думать о нём

RNK
Постоянный участник
СССР

06.03.2013 16:42

URL #9

RAPD отличный метод, но надо уметь его правильно использовать и подобрать "правильные" праймеры, а не те праймеры, что обычно используют с первоисточника 1990 года.

Очень много полезного, чего можно сделать с помощью правильных RAPD праймеров.

Думаю, что метод RAPD будет поднят на новый уровень в будущем.

-Ъ-
Постоянный участник
Москва

06.03.2013 17:46

URL #10

(Guest @ 06.03.2013 16:33)

Не надо трогать рапд. Вообще. Не надо даже думать о нём

Это почему же? В очумелых ручках очень даже ничего метод... Мы же не знаем что у The problem за идея родилась в голове.

-Ъ-
Постоянный участник
Москва

06.03.2013 17:51

URL #11

(RNK @ 06.03.2013 17:42)

Например.

Мне лично никакие патерны из статей не удавалось воспроизвести - 90 % полос исчезало, как правило.

The problem
Постоянный участник

06.03.2013 18:23

URL #12

спасибо, буду думать. Точнее, попробую, если удасться себя убедить, что по крайней мере можно сказать, что 2 штамма суть разные штаммы, то тогда и о сиквенсе можно подумать, а если будет казаться, что либо одинаковые, либо же что ответ неочевиден, тогда ...снова подумать

ipanchev

06.03.2013 18:47

URL #13

емнип в конце 90-ых у фармации был сет rapd праймеров для бактерий. но кажется он позлволял различать виды а не штаммы.
по-моему стоит попробовать стандартный набор праймеров - operon или carl roth.
rapd капризен к качеству и количеству днк в реакции. очень часто невозможно возпроизвести результат на другом аппарате.
также если различия между штаммами обязаны точковым мутациям, то вряд ли Вы увидите разницу исползуя rapd

-Ъ-
Постоянный участник
Москва

06.03.2013 18:51

URL #14

Можно воспользоваться, конечно, этим китом
http://ru-ru.invitrogen.com/site/ru/ru/hom...phism-AFLP.html
но, все-таки, правильно начать с РАПДа с выбором рандом-праймеров без всякой системы (не серийные).

RNK
Постоянный участник
СССР

06.03.2013 19:04

URL #15

(-Ъ- @ 06.03.2013 16:51)

Например.

Мне лично никакие патерны из статей не удавалось воспроизвести - 90 % полос исчезало, как правило.

RAPD в основном для личного пользования, как получаются результаты у конкретного человека с конкретными праймеры, так он с этим идет дальше. В других лабораториях вероятно будут картинки выглядить иначе, разные люди и условия реакции - приборы, полимераза и качество ДНК.

Но можно ведь найти такие праймеры которые не будут так варьировать между лабораториями, и лучшие полимеразы использовать.
Но это всё технические детали по самому RAPD методу.

Можно "поднять" данный метод на другой уровень, и не зацикливаться на том что уже известно.
Я не могу сказать, что конкретно будет сделано, но идея ПЦР со случайным праймером близка к идеи амплификации целого генома, и даже ДНК одной клетки.
Здесь есть хитрости с праймером/ами и полимеразами и последовательностью некоторых этапов.
Можно ведь выявить полиморфизм между отдельными клетками! Но надо знать как, не прибегая к секвенированию.
Это я имел в виду, под новым уровнем использования RAPD.

The problem
Постоянный участник

06.03.2013 23:28

URL #16

все, что Вы сказали- только интенция, а методически непонятно.

RNK
Постоянный участник
СССР

07.03.2013 12:20

URL #17

Это проект в разработке и я не могу особо распространяться в деталях. Цель проекта, выявление полиморфизма на уровне одной клетки, не прибегая к геномному секвенированию, без гибридизации сравниваемых геномных ДНК и прочего.

То есть изначально количество ДНК только одного ядра, и надо таким образом размножить эту ДНК, чтобы можно было одновременно выявить различия (качественные и количественные) между индивидуальными клетками.

Конечно, принцип метода RAPD здесь некоторым образом используется.

-Ъ-
Постоянный участник
Москва

07.03.2013 13:25

URL #18

На фоне вала NGS публикаций РАПДом только распугаете грантодателей.
Актуальность сравнительных исследований двух соседних клеток по полиморфизму геномов и количеству ДНК - большой вопрос.

Но в то же время можно, конечно, выбрать модель для сравнений...
Но на РАПДе на одной клетке да с одним праймером далеко не уедешь.

Лучше попробуйте сначала RCA для получения "массы материала", а потом делайте что хотите РАПД-ом с целой панелью-серией из 96 праймеров.
RCA кстати можно делать в режиме реал-тайм (для количественной оценки), и далее поставив целиком плашку с 96 праймерами можно получить инфо о каком-то полиморфизме... Вот и весь проект навскидку.

Поблагодарили (1): Nett

Nett
Постоянный участник

07.03.2013 13:32

URL #19

RNK, на ограниченном количестве материала - как Вы можете быть уверены в стабильной повторяемости результатов на одном образце? Неужели настолько мало данных о геномовиде/частоте мутаций, чтобы испльзовать RAPD? Если не ошибаюсь, минимум три-пять независимых повтора опыта надо сделать.
Имхо, ошибки прямого секвенирования выйдут в меньшую "погрешность"
Если вопрос в финансах - это другое дело.

-Ъ-
Постоянный участник
Москва

07.03.2013 14:04

URL #20

The problem, рекомендую этот 13-членный праймер для сравнения двух бакт. геномов:
5-cgagctccacatt-3, Там шпилек никаких, есть один сильный димер, но не начинающий реакцию (3-конец болтается), зато будет защищен от неспецифического отжига. Можно изменить в сторону укорочения.
По Бласту не пробивал.

The problem
Постоянный участник

07.03.2013 16:15

URL #21

а почему именно этот? по какому принципу?

RNK
Постоянный участник
СССР

07.03.2013 16:29

URL #22

(-Ъ- @ 07.03.2013 12:25)

я не имел в виду использовать RAPD метод на анализа ДНК одной клетки, RAPD вообще не упоминается, так как сейчас актуальна пропаганда NGS как наиболее эффективного метода, для всего что пожелаешь.

NGS это очередной подход перевода бюджетных денег в западные корпорации, да и зарплата сотрудникам не нужна, роботы всё сделают.

Задача нашего проекта в другом, и совсем не обязательно секвенировать каждую клетку по отдельности, чтобы сделать какие-то вселенские выводы.
Можно гораздо проще и дешевле решать сложные задачи.

Поблагодарили (1): -Ъ-

RNK
Постоянный участник
СССР

07.03.2013 16:38

URL #23

(Nett @ 07.03.2013 12:32)

Мутации наблюдаются в любой стареющий клетке, и мутации это умирание клетки. Что тут детектировать! Мутации не ценны сами по себе. Клетка умерла и собрала с собой все свои индивидуальные мутации, в новое поколении это не переходит.
Вообще, зацикленность на мутациях, как основной источник болезней и здоровья, это ущербный путь. Всё на самом-то деле, как раз и наоборот.
У стариков столько всяких неожиданных мутаций по всей ядерной и митохондриальной ДНК и в каждой клетке можно наблюдать, и что из этого следует. Да ничего.

Другое дело рекомбинации в половых клетках, которые уже наследуются.
Но здесь мейоз активно подчищает "разрушения" ДНК.

Guest
IP-штамп: frF63nlCtDizk
гость

07.03.2013 17:19

URL #24

Для любого метода просто надо найти уместное применение. Если Вы хотите получить стабильный, хорошо воспроизводящийся паттерн, то Ваш выбор, что-нибудь типа AFLP.
Если хотите сравнить популяции по разнообразию или выявить в популяции клонов измененные варианты - RAPD вполне подойдет. Только надо помнить, что метод весьма чувствителен ко всему - к типу полимеразы, к температурному профилю ПЦР, к стартовой концентрации ДНК. Ну и конечно то, что даже в редакционной политике некоторых уважаемых журналов ясно написано - RAPD не принимаем...
А так, если берете группу штаммов в одной амплификации для определенных задач - до сих пор весьма эффективное решение.

Поблагодарили (1): -Ъ-

-Ъ-
Постоянный участник
Москва

07.03.2013 19:43

URL #25

(The problem @ 07.03.2013 17:15)

а почему именно этот? по какому принципу?

Ожидаемый вопрос. Но никаких умных ответов - без принципа, с потолка.
https://www.google.ru/url?sa=t&rct=j&q=&esr...4,d.bGE&cad=rjt
Метод получения максимально большого количества неспецифических полос!

Сообщение было отредактировано -Ъ- - 07.03.2013 19:49

-Ъ-
Постоянный участник
Москва

07.03.2013 19:45

URL #26

(RNK @ 07.03.2013 17:29)

Я во многом солидарен с Вами.

abdula
Постоянный участник

07.03.2013 21:27

URL #27

(The problem @ 06.03.2013 10:09)

Обладает ли кто инфо по структурам праймеров для РАПД бактериальных геномов, принципы выбора, возможные структуры, ссылки для поиска

зачем вам рапд на бактериях если сто геномов изолятов сиквинируются за один день

abdula
Постоянный участник

07.03.2013 21:30

URL #28

(The problem @ 06.03.2013 10:09)

бактериев сейчас сравнивают на уровне геномофф а не рапдофф

Поблагодарили (1): Nett

abdula
Постоянный участник

07.03.2013 21:39

URL #29

(The problem @ 06.03.2013 10:09)

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3378690/

RNK
Постоянный участник
СССР

08.03.2013 00:55

URL #30

(-Ъ- @ 07.03.2013 18:45)

Я во многом солидарен с Вами.

Monday 26th June 2000 will be remembered as the day when humankind learned, in a sense, what it is to be human. You might be forgiven for thinking something momentous has happened. You may even remember for me rest of your life what you were doing when the news reached you.
Certainly, some important people thought something important had happened.

Bill Clinton said, "This is the most wondrous map ever produced by mankind."

Tony Blair called it, "a breakthrough that opens the way for massive advancement in the treatment of cancer and hereditary diseases, and that is only the beginning."

So what in fact had happened? The leaders of the publicly sponsored Human Genome Project (HGP) and Craig Venter who leads the parallel private initiative of the company Celera Genomics chose that day to announce that they had completed the first working draft of the complete set of human genetic information, the human genome.

Furthermore, with some 3.1 billion base pairs in the genome even when the whole genome has been sequenced to that accuracy, there could remain some 310,000 errors, and these in only a 'generic' genome of the few who contributed their DNA to the sample. There remain too the genetic differences between human individuals. These are important if Tony Blair's prediction for disease treatment is to be realised. These differences, most of which are accounted for by 'single nucleotide polymorphisms' (SNPs), are also receiving intensive research and with the extraordinary acceleration of the project through mechanisation combined with computing power, sequencing the genomes of individuals may be only a few years off.

However, I believe that placing so much hope for the future of medicine on knowing the human or the individual's genome is a big mistake. Tony Blair hopes that it will advance the treatment of cancer. But a recent study of medical records of 44,788 pairs of twins born in Sweden, Denmark and Finland since 1870 concluded that overall, if one identical twin had cancer, his or her sibling had a less than 10% chance of contracting the same disease.
Clearly, this statistic alone shows that knowing genomes is not going to solve the cancer problem for most people. Incidentally, the authors concluded from this finding that environmental factors are of overwhelming importance in the aetiology of cancer, but in the light of comments in the previous paragraph that would be too simple a conclusion.

Mapping and sequencing the human genome will lead to the identification of more genes causing Mendelian disorders and to the diagnostic and predictive tests for them. But most of the human bodily form and function cannot be accounted for in terms of Mendelian inheritance, that is, the linking up of characteristics or traits which geneticists call phenotypes, abstracted from the totality of the organism, with associated inheritable markers called genotypes.
.....

watchesbiz
Постоянный участник

07.12.2021 15:20

URL #31

http://replicarolexwatches.simpsite.nl/
https://www.smore.com/rj7kh-best-replica-watches
https://www.athleticsnation.com/users/Replicarolexwatches
https://pastebin.pl/view/ab0e458a
https://mix.com/watcheshutukcom
https://www.woddal.com/post/359216_tiny-acc...nybody-039.html
https://share.naturalnews.com/posts/3904099
https://demo.wowonder.com/post/214429_the-i...-producers.html
https://rapichat.com/post/5369_our-purpose-...ible-there.html
https://dashburst.com/replicarolexwatches/1
https://sway.office.com/KifcQvn36MK821G8
https://flipboard.com/@replicarolex24
https://getpocket.com/redirect?url=https%3A...eshut.uk.com%2F
https://www.openstreetmap.org/user/Hints%20...20Rolex%20Watch

nigoal123
IP-штамп: fr/1ZkUsuBQOE
гость

27.05.2022 06:57

URL #32

The first sentence has nigoal one single purpose ลิงค์รับทรัพย์ to entice the reader to sexy gaming Write in a semi-informal dream gaming read the next sentence. ka gaming rewarding to satisfy curiosity.

it sets the tone for 123goal the rest of the article 11hilo hooking the reader in 123bets choose the best three or four. pggame123 one step at a time. big gaming are intrigued by a question

guest: 123
IP-штамп: frJhOCvSv9ICE
гость

02.06.2022 12:19

URL #33

For years there 123VEGA have been FA CHAI SLOT calls for Asia - which JILI SLOT is home to some PRAGMATIC PLAY of the world's สล็อตPG biggest CO2 emitters - to ditch fossil fuels 11HILO to help tackle climate AMB CASINO change. Countries in the region - including FC SLOT its three biggest economies 88KTC China, Japan and India - were criticised last year 123GOAL for not making a bigger.