Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
кудрявцева |
|
AlexRez Постоянный участник Екатеринбург |
|
Pit Москва |
|
R.J.Dio Постоянный участник |
Сообщение было отредактировано R.J.Dio - 03.06.2014 11:02
|
кудрявцева |
Сообщение было отредактировано кудрявцева - 03.06.2014 12:49 |
кудрявцева |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(кудрявцева @ 03.06.2014 11:13) Не очень понятно на сколько нуклеотидов перекрываются два ПЦР продукта? 5 и 3 ? Можно предложить два варианта.... |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(кудрявцева @ 03.06.2014 13:36) Спасибо!!!! Я поняла - наша ошибка, что мы не пускаем фрагмент после короткой ПЦР сразу в нормальную, не надо проверять результат на форезе!!! Да, в правильном направлении двигаетесь. |
R.J.Dio Постоянный участник |
(-Ъ- @ 03.06.2014 13:42) Не очень понятно на сколько нуклеотидов перекрываются два ПЦР продукта? 5 и 3 ? Можно предложить два варианта.... видимо, на эти 18 и перекрываются. Тогда где-то около 60 гр и получится, 56 там, не суть
|
кудрявцева |
(R.J.Dio @ 03.06.2014 11:59) Вы все правильно делаете, я бы для начала немного изменил параметры реакции- 94 (95)- 15 сек хватит, далее 50 (?кстати, почему 50, может, можно больше- посчитайте темп. отжига общей для обоих фрагментов части), - 3 мин, потом 72- ставьте 1 мин для 1 килобазы- вы не указали длину фрагментов. Ну а после своих 6 (не 7-хватит) циклов отжига- достройки сделайте еще 8-9 циклов нормального ПЦР, то есть добавьте концевые праймеры прямо в то, что у вас есть после описанной выше процедуры, перемешайте и продолжайте. Наивно думать, что все фрагменты количественно всосутся и достроятся до полноразмерного продукта- поскольку это реакция второго порядка, то и скорость падает очень быстро по мере достройки. Именно, что надо докрутить нормальным ПЦР до весовых количеств, при этом исходные фрагменты аплифицируются линейно и вас не беспокоят Скажите, а добавлять Tag-полимеразу и нуклеотиды в нормальную ПЦР после "фьюжн" не надо? Хватит ли для синтеза того количества, что есть в смеси? |
R.J.Dio Постоянный участник |
|
xenopus Постоянный участник Moscow |
|
R.J.Dio Постоянный участник |
|
кудрявцева |
(R.J.Dio @ 03.06.2014 16:40) Вы имеете ввиду, что после схлопа-достройки в момент добавления праймеров надо ли добавлять полимеразу и буквы? Зачем, у Вас ничего же не израсходовалось толком, если даже первые 6-7 "циклов" считать за обычный ПЦР, это ничто. Кстати. надеюсь, слово "Taq" Вы употребили просто, а на самом деле работаете нормальными высокоточными смесями? Спасибо, я поняла, что на достройку тратится мизерное количество. О полимеразе... Мы работаем с Taq-полимеразой... Что есть, то есть, выбирать не приходится. |
кудрявцева |
(xenopus @ 03.06.2014 20:49) Я так делаю - 3 цикла без праймеров, потом прям в смесь добавляю праймеры и еще +10циклов. Все идет со свистом. Надеюсь, амплификаты Вы берете почищенные? Да, мы элюируем их из геля коммерческим набором. Будем пробовать все предложенные варианты. Спасибо. Спасибо, Мастера, за помощь!!! Сообщение было отредактировано кудрявцева - 04.06.2014 10:09 |
R.J.Dio Постоянный участник |
|
кудрявцева |
(R.J.Dio @ 04.06.2014 11:10) элюция из геля- это правильно. А вот полимеразу надо непременно менять, а не то ошибок наловите, всенепременно. На сиквенсах потеряете больше, чем на стоимости нормальных смесей А какие смеси Вы бы посоветовали? Сиквенс ведь все равно надо будет делать... |
R.J.Dio Постоянный участник |
|
watchesonline89 Постоянный участник |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |