Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
pticcca Участник |
Конструкт такои: GST - thrombin cutting site - The protein У кого-нибудь имеетса положительний опыт очистки GST-tagged proteins? Вернее - последуюшего отрезаниа тага тромбином ?! videla dva ochen# neudachnix primera - nichego u naroda ne otrezalos'. Sama probovala (neudachno) odin raz... i batch i na kolonke - nichego ne rezhetsia. Vot dumayu - stoit li eshe raz probovat' eshe raz.... Сообщение было отредактировано pticcca - 12.07.2005 16:30 |
Serpent Постоянный участник RU-->IT |
Вы тромбин разведенный пользуете или как? В моем случае все порезалось после инкубации overnight с 1 ul неразведенного тромбина (Novagen) на колонке. |
E. Постоянный участник |
Либо порезать не на колонке, а в растворе (так тромбин у меня лучше работал). |
pticcca Участник |
for 5 ml of the sample 50 μl of Thrombin (250 units in 1,25 ml) left at room temperature overnight (at shaker - крутящийся :-)) так делала с элюатом и прямо на колонке - результат однозначный - не режется. Тромбин кажется был Serva |
pticcca Участник |
1 ul неразведенного - это как? это в смысле микролитр или я чего-то не понимаю? Сообщение было отредактировано pticcca - 12.07.2005 18:52 |
Serpent Постоянный участник RU-->IT |
|
pticcca Участник |
(Serpent @ 12.07.2005 17:01) Микролитр, конечно. Еквивалентно 1 юниту примерно, по мануалу. Кстати, на ночь я его оставлял при комнатной температуре. А объем того, что резалось, какой??! |
Guest IP-штамп: frlkSmZr37YvE гость |
gostya |
Serpent Постоянный участник RU-->IT |
145 mikrolitrov |
pticcca Участник |
(Serpent @ 12.07.2005 17:31) это со смолой-то?! а в каком объеме экспрессировали?! Сообщение было отредактировано pticcca - 12.07.2005 20:09 |
Serpent Постоянный участник RU-->IT |
|
yack moderator Москва, Россия |
намного специфичнее, но и намного менее активна Большой ее плюс, что можно самим начистить, а не покупать. |
FullText Постоянный участник |
(pticcca @ 12.07.2005 14:27) похоже наметился профессиональный рост?! ещё неделю назад клиент отказывался понимать слово "бетч" |
Mac-1 Постоянный участник оттуда |
Лет 5 назад чистил ГСТ с тромбиновым кливиджем, результат - позитивный. Тромбин сигмовский, с высокой активностью (2800-3200 NIH/мг), соотношение (по массе) очищенный GST-белок:тромбин 150-250:1 (точнее не помню) - инкубировал в растворе 2-4 часа при 37 градусах на орбитальном шейкере. Резал сразу где-то 5-15 мг белка (его нужно было много). Сначала проводил пилотный протеолиз 1-24 ч, отбирая пробы и смотрел по форезу что с белком происходит (o/n здорово деградировал). Отрезанный ГСТ от белка отделял на MonoQ в обычном трисе рН 7.4, градиентом 0.15М-1 М Натрий хлорид, это было быстрее и чище, чем смолой (но это касалось в основном только моего белка). А вообще, лучше пользоватся "Фактор 10 кливидж сайт": специфичнее, сам белок не порежешь... |
Guest IP-штамп: frBiEwkx2nBBs гость |
|
pticcca Участник |
в мануале про ГСТ пишут, что это могут быть шаперонины... и предлагается много всего проделать.... Так вот вопрос: если всё-таки сразу тромбином эту смесь - совсем дохлый номер или всё-таки нет ? Или потом просто придется морочиться с очисткой конечного продукта (если что-то отщепится конечно).....?! |
Guest IP-штамп: frlkSmZr37YvE гость |
gostya |
guest-n Участник |
ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ФОРМИРОВАНИЯ НАТИВНОЙ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ СТРУКТУРЫ БЕЛКОВ Автор: Н. К. Наградова Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова ВВЕДЕНИЕ К настоящему времени описано несколько классов шаперонов, различающихся по структуре и специфическим функциям. Все шапероны являются так называемыми "белками теплового шока", синтез которых резко увеличивается в стрессовых для клетки ситуациях. Поэтому сокращенное название этих белков - hsp (heat shock proteins). Однако и в нормальных условиях каждая клетка содержит определенный набор шаперонов, необходимых для ее жизнедеятельности. Классификация шаперонов основана на величине молекулярной массы составляющих их полипептидных цепей (субъединиц), которая варьирует от 10 кДа (килодальтонов) (для белка hsp 10) до 90 кДа (для белка hsp90) и выше. По характеру выполняемых этими белками функций их можно разделить на два больших семейства шапероны, или hsp70, и шаперонины, к которым относятся hsp60 и hsp10. Шаперонины, обеспечивающие эффективное сворачивание белков. Скорее всего, клетка располагает высокоорганизованными ансамблями белков, действующих согласованно. В состав таких ансамблей, вероятно, образующихся в цитозоле эукариотической клетки, входят, помимо hsp70, шапероны других типов (например, hsp90 и связанные с ним низкомолекулярные шапероны, не требующие АТФ для своего функционирования), ферменты, ускоряющие процесс сворачивания, а также ряд других белков, роль которых пока остается неясной. |
Nameless Постоянный участник CA |
|
Fedo Постоянный участник Nemetchina |
На уме только pGEX-4Т тот что с тромбином с 3 фреймами... + pGEX drugie... pET-41 и pET-42, но в них кроме GST есчо и His Таг и есчо куча всего... |
pticcca Участник |
Вроде мыла ее, как рекомендуется (кроме 6M гуанидина)... Сообщение было отредактировано pticcca - 29.07.2005 11:48 |
Guest IP-штамп: frBiEwkx2nBBs гость |
Nameless |
Glebber Постоянный участник London, UK |
|
pticcca Участник |
Тест показал, что хороший тромбин всё благополучно режет, так что надежда есть :-) Вот после отпуска и займусь :-) |
yche |
проблема такая -после очистки GSTfussin protein вместо моего одного нужного бенда вижу 2.(WB antiGSTAb). Второй в раёне [26kDa]Раз в 5-10 интенсивнее первого. Никак не могу от него избавиться.Пропускала через фильтр [50kDa],думала он уйдет сквозь фильтр, останется только то, что мне нужно. Ан НЕТ! Помогите пожалуйста советом:-) |
Tom1 Постоянный участник |
Смотря какаой размер фьюжена... если разница как 26 (в принципе 28_ и под сотню есть шанас на гельфильтрации поделить.... а так можно ионообменник попробовать.... |
Guest IP-штамп: fr9qlgRVaGzZA гость |
gostya |
Guest IP-штамп: fr9qlgRVaGzZA гость |
|
nigoal123 IP-штамп: fr/1ZkUsuBQOE гость |
A well-structured |
guest: 123 IP-штамп: frJhOCvSv9ICE гость |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |