Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Gst-tags -- anybody succeeded? --
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! pticcca
Участник



 прочитанное сообщение 12.07.2005 16:27     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Дорогие Коллеги !

Конструкт такои: GST - thrombin cutting site - The protein

У кого-нибудь имеетса положительний опыт очистки GST-tagged proteins?
Вернее - последуюшего отрезаниа тага тромбином ?!

confused.gif mol.gif mol.gif mol.gif



videla dva ochen# neudachnix primera - nichego u naroda ne otrezalos'.
Sama probovala (neudachno) odin raz... i batch i na kolonke - nichego ne rezhetsia.


Vot dumayu - stoit li eshe raz probovat' eshe raz....

Сообщение было отредактировано pticcca - 12.07.2005 16:30
Участник оффлайн! Serpent
Постоянный участник
RU-->IT



 прочитанное сообщение 12.07.2005 16:42     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

Недавно только сам мучался с этим тромбином... Однако напишите подробнее, как пытались порезать. Может, надо подольше поинкубировать, или там температуру поднять.
Вы тромбин разведенный пользуете или как? В моем случае все порезалось после инкубации overnight с 1 ul неразведенного тромбина (Novagen) на колонке.
Участник оффлайн! E.
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 12.07.2005 18:44     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

overnight +4, а затем часок при комнатной.
Либо порезать не на колонке, а в растворе (так тромбин у меня лучше работал).
Участник оффлайн! pticcca
Участник



 прочитанное сообщение 12.07.2005 18:45     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

Дело было так:

for 5 ml of the sample 50 μl of Thrombin (250 units in 1,25 ml)
left at room temperature overnight (at shaker - крутящийся :-))


так делала с элюатом и прямо на колонке - результат однозначный - не режется.
Тромбин кажется был Serva
Участник оффлайн! pticcca
Участник



 прочитанное сообщение 12.07.2005 18:47     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

опа, похоже надо больше заварки (то есть тромбина) класть yes.gif

1 ul неразведенного - это как? shuffle.gif это в смысле микролитр или я чего-то не понимаю?

Сообщение было отредактировано pticcca - 12.07.2005 18:52
Участник оффлайн! Serpent
Постоянный участник
RU-->IT



 прочитанное сообщение 12.07.2005 19:01     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

Микролитр, конечно. Еквивалентно 1 юниту примерно, по мануалу. Кстати, на ночь я его оставлял при комнатной температуре.
Участник оффлайн! pticcca
Участник



 прочитанное сообщение 12.07.2005 19:09     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

(Serpent @ 12.07.2005 17:01)
Ссылка на исходное сообщение  Микролитр, конечно. Еквивалентно 1 юниту примерно, по мануалу. Кстати, на ночь я его оставлял при комнатной температуре.



А объем того, что резалось, какой??!
Guest
IP-штамп: frlkSmZr37YvE
гость



 прочитанное сообщение 12.07.2005 19:25     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

а TEV лучше? у кого какой опыт?

gostya
Участник оффлайн! Serpent
Постоянный участник
RU-->IT



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  12.07.2005 19:31     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

2 pticcca:
145 mikrolitrov
Участник оффлайн! pticcca
Участник



 прочитанное сообщение 12.07.2005 20:08     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

(Serpent @ 12.07.2005 17:31)
Ссылка на исходное сообщение  2 pticcca:
145 mikrolitrov


это со смолой-то?!
а в каком объеме экспрессировали?!

Сообщение было отредактировано pticcca - 12.07.2005 20:09
Участник оффлайн! Serpent
Постоянный участник
RU-->IT



 прочитанное сообщение 12.07.2005 20:12     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

Нет, без смолы. Это был обьем наносимой на мини-колонку реакционной смеси. В колонке же было примерно 150 микролитров beads.
Участник оффлайн! yack
moderator
Москва, Россия



 прочитанное сообщение 14.07.2005 13:51     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

TEV странная фишка
намного специфичнее, но и намного менее активна
Большой ее плюс, что можно самим начистить, а не покупать.
Участник оффлайн! FullText
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 14.07.2005 15:31     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

(pticcca @ 12.07.2005 14:27)
Ссылка на исходное сообщение ...i batch i na kolonke....

похоже наметился профессиональный рост?! ещё неделю назад клиент отказывался понимать слово "бетч" wink.gif
Участник оффлайн! Mac-1
Постоянный участник
оттуда



 прочитанное сообщение 14.07.2005 18:59     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #14 множественное цитирование

Нужно покупать хороший и свежий тромбин: алфа-тромбин, (который нужен) довольно быстро автолизируется в малоактивные бета- и гамма- форму (гамма-тромбин имеет активность около 4 NIH ед/мг, алфа-тромбин - до 3200 NIH/мг)

Лет 5 назад чистил ГСТ с тромбиновым кливиджем, результат - позитивный.
Тромбин сигмовский, с высокой активностью (2800-3200 NIH/мг), соотношение (по массе) очищенный GST-белок:тромбин 150-250:1 (точнее не помню) - инкубировал в растворе 2-4 часа при 37 градусах на орбитальном шейкере. Резал сразу где-то 5-15 мг белка (его нужно было много).

Сначала проводил пилотный протеолиз 1-24 ч, отбирая пробы и смотрел по форезу что с белком происходит (o/n здорово деградировал).
Отрезанный ГСТ от белка отделял на MonoQ в обычном трисе рН 7.4, градиентом 0.15М-1 М Натрий хлорид, это было быстрее и чище, чем смолой (но это касалось в основном только моего белка).

А вообще, лучше пользоватся "Фактор 10 кливидж сайт": специфичнее, сам белок не порежешь...
Guest
IP-штамп: frBiEwkx2nBBs
гость



 прочитанное сообщение 17.07.2005 01:14     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #15 множественное цитирование

У нас к 0.5 мл сепхарозы добавляют 1 мл ПБС/10 унитс тромбина, инцубируют с медленным покачиваниэм сначала 1 час РТ, снимают 1 мл, добавляют ече 1 мл ПБС/10 унитс тромбина и инцубируут при 4Ц ОН. Выход обычно хорошы.
Участник оффлайн! pticcca
Участник



 прочитанное сообщение 20.07.2005 18:34     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #16 множественное цитирование

Ох, вот вижу я гель после очистки белка на ГСТ - колонке... Вместе с моим белком (42 кДа)есть еще что-то около 30, 50, 55, 70...


в мануале про ГСТ пишут, что это могут быть шаперонины... и предлагается много всего проделать....

Так вот вопрос: если всё-таки сразу тромбином эту смесь - совсем дохлый номер или всё-таки нет ? Или потом просто придется морочиться с очисткой конечного продукта (если что-то отщепится конечно).....?! weep.gif confused.gif frown.gif
Guest
IP-штамп: frlkSmZr37YvE
гость



 прочитанное сообщение 20.07.2005 19:57     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #17 множественное цитирование

это шапероны, на АТФ-сефарозе их чистят

gostya
Участник оффлайн! guest-n
Участник



 прочитанное сообщение 20.07.2005 21:34     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #18 множественное цитирование

http://inventors.ru/index.asp?mode=4234

ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ФОРМИРОВАНИЯ НАТИВНОЙ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ СТРУКТУРЫ БЕЛКОВ
Автор: Н. К. Наградова
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова
ВВЕДЕНИЕ


К настоящему времени описано несколько классов шаперонов, различающихся по структуре и специфическим функциям. Все шапероны являются так называемыми "белками теплового шока", синтез которых резко увеличивается в стрессовых для клетки ситуациях. Поэтому сокращенное название этих белков - hsp (heat shock proteins). Однако и в нормальных условиях каждая клетка содержит определенный набор шаперонов, необходимых для ее жизнедеятельности. Классификация шаперонов основана на величине молекулярной массы составляющих их полипептидных цепей (субъединиц), которая варьирует от 10 кДа (килодальтонов) (для белка hsp 10) до 90 кДа (для белка hsp90) и выше. По характеру выполняемых этими белками функций их можно разделить на два больших семейства шапероны, или hsp70, и шаперонины, к которым относятся hsp60 и hsp10.

Шаперонины, обеспечивающие эффективное сворачивание белков.

Скорее всего, клетка располагает высокоорганизованными ансамблями белков, действующих согласованно. В состав таких ансамблей, вероятно, образующихся в цитозоле эукариотической клетки, входят, помимо hsp70, шапероны других типов (например, hsp90 и связанные с ним низкомолекулярные шапероны, не требующие АТФ для своего функционирования), ферменты, ускоряющие процесс сворачивания, а также ряд других белков, роль которых пока остается неясной.
Участник оффлайн! Nameless
Постоянный участник
CA



 прочитанное сообщение 20.07.2005 22:43     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #19 множественное цитирование

на GST чтобы не было примесей надо мыть много раз после связывания. мы моем PBS до А280<0.01, потом TBS и опять PBS до А280<0.01. полностью грязь конечно не убирает, но помогает очень хорошо.
Участник оффлайн! Fedo
Постоянный участник
Nemetchina



 прочитанное сообщение 21.07.2005 00:01     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  ICQ
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #20 множественное цитирование

А кто какие вектoрbl использует для GST Тага?
На уме только pGEX-4Т тот что с тромбином с 3 фреймами... + pGEX drugie...
pET-41 и pET-42, но в них кроме GST есчо и His Таг и есчо куча всего...
Участник оффлайн! pticcca
Участник



 прочитанное сообщение 29.07.2005 11:48     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #21 множественное цитирование

...Просто упорно белок не хочет связываться с той же смолой по второму разу...
Вроде мыла ее, как рекомендуется (кроме 6M гуанидина)... frown.gif

Сообщение было отредактировано pticcca - 29.07.2005 11:48
Guest
IP-штамп: frBiEwkx2nBBs
гость



 прочитанное сообщение 30.07.2005 02:01     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #22 множественное цитирование

А после отмывки снимали отрезанные хвосты оставшиеся нa колонке глутатионом wink.gif?

Nameless
Участник оффлайн! Glebber
Постоянный участник
London, UK



 прочитанное сообщение 30.07.2005 19:31     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #23 множественное цитирование

помойте гуанидиномsmile.gif
Участник оффлайн! pticcca
Участник



 прочитанное сообщение 02.08.2005 01:06     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #24 множественное цитирование

Ага, помою...
Тест показал, что хороший тромбин всё благополучно режет, так что надежда есть :-)
Вот после отпуска и займусь :-) jump.gif
Участник оффлайн! yche




 прочитанное сообщение 21.08.2005 15:31     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #25 множественное цитирование

Всем привет!
проблема такая -после очистки GSTfussin protein вместо моего одного нужного бенда вижу 2.(WB antiGSTAb). Второй в раёне [26kDa]Раз в 5-10 интенсивнее первого. Никак не могу от него избавиться.Пропускала через фильтр [50kDa],думала он уйдет сквозь фильтр, останется только то, что мне нужно. Ан НЕТ!

Помогите пожалуйста советом:-)
Участник оффлайн! Tom1
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 21.08.2005 16:29     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #26 множественное цитирование

это ГСТ сам по себе...
Смотря какаой размер фьюжена... если разница как 26 (в принципе 28_ и под сотню есть шанас на гельфильтрации поделить....
а так можно ионообменник попробовать....
Guest
IP-штамп: fr9qlgRVaGzZA
гость



 прочитанное сообщение 21.08.2005 16:53     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #27 множественное цитирование

на моноQ они вместе идут, не знаю как на других ионнобменниках

gostya
Guest
IP-штамп: fr9qlgRVaGzZA
гость



 прочитанное сообщение 21.08.2005 17:08     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #28 множественное цитирование

хотя у меня был сайт для TEV после GST, я думала это деградация фьюжена
nigoal123
IP-штамп: fr/1ZkUsuBQOE
гость



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  23.05.2022 12:12     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #29 множественное цитирование

The secret to 123GOAL good article writing is to 11hilo understand how สล็อต123 to plan and structure a บาคาร่าออนไลน์ piece before slotxo you write it.

A well-structured ลิงค์รับทรัพย์ article allows you to use nigoal your writing skills to sexy gaming best advantage and dreamgaming communicate your ideas nigoal 50รับ100 correctly, concisely, clearly, coherently, and completely.
guest: 123
IP-штамп: frJhOCvSv9ICE
гость



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  02.06.2022 12:21     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #30 множественное цитирование

For years there 123VEGA have been FA CHAI SLOT calls for Asia - which JILI SLOT is home to some PRAGMATIC PLAY of the world's สล็อตPG biggest CO2 emitters - to ditch fossil fuels 11HILO to help tackle climate AMB CASINO change. Countries in the region - including FC SLOT its three biggest economies 88KTC China, Japan and India - were criticised last year 123GOAL for not making a bigger.

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 28.03.24 20:14
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft