Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Quick Change ПЦР мутагенез -- Не садятся праймеры на матрицу --
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


опрос: Quick Change ПЦР мутагенез  (Всего голосов: 1)   
Мало матрицы и праймеров    1 (100%)
Слишком длинные праймеры    0 (0%)
   Гости не могут участвовать в голосовании

Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! Sergeant
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 09.05.2016 16:50     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #51 множественное цитирование

Эффективность лигазы и транформацию сложно проверить.

Давно это сложно стало?
1. Трансформация. Развезти плазмиду, трансформировать коли да подсчитать клоны.
2. Лигирование. Порезать любую празмиду рестриктазой с тупыми концами. почистить в геле. поставить лигирование саму на себя. Взять на трансформацию аликвоту без лигазы(бегграунд), после лигирования, ну и не резаную плазмиду.
посчитать клоны
3. T4 киназа. взять линейную плазмиду, дефосфориликовать, потом фосфорилировать, лигировать, трансформировать. На каждой стадии аликвоту на трансформацию.
Участник оффлайн! NMR-guy
Постоянный участник
временной жизни



 прочитанное сообщение 09.05.2016 16:53     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #52 множественное цитирование

Простите, увидел что у Вас электрокомпетентные клетки и с ними все хорошо.

Чо, тогда срезы циклов, контроль лигирования (разрежьте стоковый вектор). Ну и гели ПЦР-стадии, разных температур-времен отжига/элонгации и срезы циклов... Гели-гели-гели.
Участник оффлайн! NMR-guy
Постоянный участник
временной жизни



 прочитанное сообщение 09.05.2016 17:01     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #53 множественное цитирование

(Sergeant @ 09.05.2016 16:50)
Ссылка на исходное сообщение  Давно это сложно стало?
1. Трансформация. Развезти плазмиду, трансформировать коли да подсчитать клоны.
2. Лигирование. Порезать любую празмиду рестриктазой с тупыми концами. почистить в геле. поставить лигирование саму на себя. Взять на трансформацию аликвоту без лигазы(бегграунд), после лигирования, ну и не резаную плазмиду.
посчитать клоны
3. T4 киназа. взять линейную плазмиду, дефосфориликовать, потом фосфорилировать, лигировать, трансформировать. На каждой стадии аликвоту на трансформацию.

1. 0-0-0-0-0-0-0-0 = Развели, получилось так, контроль 128-64-32-16-8-4-2-1. Что дальше? Как разведение при нулях на транформации отличить от проблем в лигировании, если при любых пропорциях целевой фрагмент не растет в колониях вообще?

2. Это классика, и она работает если лигирование идет. Если мы режем плазмиду и чистим, а на выходе получаем 0 проросших колоний со всех разведений - опять не понятно что не работает, но имеется уже 2 плазмиды на которых это не работает. Такое маловероятно, но возможно.

3. Это тоже работает когда нет сомнений в трансформации, и опять же, разного размера плазмиды в линейном виде могут не очень хорошо быть контролем друг друга.

Именно по этой причине я прошу вопрошающую почаще ставить гели с контролями и выложить сюда хоть что-то. Унести на флешке домой или в jpg-файл преобразовать и выложить.
Участник оффлайн! Sergeant
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 09.05.2016 18:37     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #54 множественное цитирование

Я не говорил, что все контроли идеальны. Но из них можно выудить злую кучу информации. Самое дурацкое это ничего не делать и ждать, что проблема как то сама рассосется.
А топикстартера я бы предостерег качать права с коллегами. По любому ее сделают крайней девочкой для битья. В такой бы ситуации я бы втихоря наладил метод. вот когда у вас в месяц будет выходить по 30 доказанных мутантов, то только тогда можно заикнуться, что вы чтото меняли в методике. А можно и не раскрывать карты. Клепайте своих мутантов и радуйтесь жизни. Ох уж эти Russian people
Участник оффлайн! MartinKatya




 прочитанное сообщение 09.05.2016 20:09     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #55 множественное цитирование

Ничего-ничего, люди по 5 раз реакцию сначала начинают, чтобы получилось - меняют и реактивы и дорабатывают матрицу и программы подбирают - выходит рано или поздно! Зато потом всё сразу ясно как день становится smile.gif
Участник оффлайн! Esya
Постоянный участник
PA, USA



 прочитанное сообщение 09.05.2016 20:22     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес  ICQ
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #56 множественное цитирование

(MartinKatya @ 09.05.2016 12:09)
Ссылка на исходное сообщение  Ничего-ничего, люди по 5 раз реакцию сначала начинают, чтобы получилось - меняют и реактивы и дорабатывают матрицу и программы подбирают - выходит рано или поздно! Зато потом всё сразу ясно как день становится smile.gif


это не про этот метод, если вы покупаете кит, то он вам практически гарантирует мутацию в любой плазмиде при условии правильных (в широком диапазоне) праймеров
проблемы начинаются, когда нет кита, а есть левая полимераза, 0.2 мкМ нуклеотидов и непонятная DpnI ... и клетки с неизвестной эффективностью

В наших условиях, если делает студент, проще кит купить, дешевле обойдется.
Участник оффлайн! MartinKatya




 прочитанное сообщение 09.05.2016 21:42     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #57 множественное цитирование

Какая разница - кит или свой сбор, главное чтобы всё работало и никаких поблажек на "если другого нет", а клетки так в любом случае должны быть свежие, раз за месяц фирменные уже теряют компетентность вдвое.
Участник оффлайн! Mila san

Japan



 прочитанное сообщение 10.05.2016 02:30     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #58 множественное цитирование

[quote=Sergeant,09.05.2016 16:42]Ссылка на исходное сообщение  То что японец легко увидет, русский только после бутылки водки может разглядеть. Сначала ПРОСТО (без мутагенеза) проверьте праймеры и полимеразу.
Поставте 25-30 циклов амплификации. Если продукта нет - есть повод задуматься. может у вас праймеры просто не отжигаются. если продукт есть, делайте мутагенез и ищите ошибку в другом месте. А голову форезами больше ни себе ни другим не забевайте.
если с ПЦР все нормально то следущим пунктом я бы проверил лигирование. это следущее бутылочное горлышко в этом протоколе. И не забудьте проверить Т4 киназу.
[/quo

Стадия лигирования отсутствует, в том то и прикол, что берут реактивы для амплификации с TOYOBO, а пытаются работать по методике QuickChange, тк там не предусмотренастадия лигирования. Соответственно, при разработке праймеров соблюдали условия Данные в методике QuickChange. В общем....голова кругом shuffle.gif
Участник оффлайн! Mila san

Japan



 прочитанное сообщение 10.05.2016 02:36     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #59 множественное цитирование

(guest: NMR-guy @ 09.05.2016 17:31)
Ссылка на исходное сообщение  А Вы там изучите вопрос как они в Фукусиме реактор глушили, когда стало понятно, что добром не кончится. Вы попали в страну, где угодить начальству и не спорить с ним - всё. А всё остальное - да гори оно огнем. Будьте там осторожны. Если куратор Вашего тютора японец и он увидит, что Вы находите за "тютором" ошибки, будучи женщиной и младше - то на Вас безотносительно Вашей науки могут поставить крест.


Да, у нас один общий профессор, и один общий проект, но разные части его мы выполняем...изначально меня думаю брали, как просто имимдж лабы, типа европейка, еще и девочка.... wink.gif
Участник оффлайн! Sergeant
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 10.05.2016 10:15     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #60 множественное цитирование

Ну в общем то понятен ход мысли сумрачного японского разума. Если топикстартеру интересно то готов разложить то полочкам японскую логику. Прийду сейчас на работу и могу вам разьяснить ситуЁвину.
Участник оффлайн! Mila san

Japan



 прочитанное сообщение 10.05.2016 10:24     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #61 множественное цитирование

(Sergeant @ 10.05.2016 11:15)
Ссылка на исходное сообщение  Ну в общем то понятен ход мысли сумрачного японского разума. Если топикстартеру  интересно то готов разложить то полочкам японскую логику. Прийду сейчас на работу и могу вам разьяснить ситуЁвину.


Конечно, разложите все по пополочкам и как можно все-таки в моем эксперименте наконец получить результат! Благодарна заранее!
Участник оффлайн! Sergeant
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 10.05.2016 12:46     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #62 множественное цитирование

Буду танцевать от печки. В случае топикстартера рекомендую посидеть часок под цветущей сакурой.
Метод сайт-направленного мутагенеза прежде всего определяется дизайном ПРАЙМЕРОВ. Все остальное уже вторично. У вас действительно КвикЧеньж. Главная его идея использование двух взаимно-комплиментарных праймеров. Мутация вносим в середину праймеров. Условно каждый праймер можно рассматривать как комбинацию из двух комплиментарных праймеров- правого и левого плеча, которые соединены между собой некомплиментарным спейсером. Если принять такую условность то очень просто подбирать мутантные праймеры. можно даже написать простенький скрипт, который будет делать это автоматически, что минимизирует ошибки. Ну или воспользоваться онлайн/офлайн совтом если уж совсем алгаритмически безграмотны.
В чем приемущества Квикченьжа? Быстро, нет стадии лигирования ПЦР продукта. Для лигирования нужны фосфатные группы на 5' конце. Поэтому и киназная реакция тоже не нужна. Число циклов амплификации 12-16. За такое число циклов число ошибок полимеразы не велико. Вам же не нужны спонтанные мутации рассыпаные по всей матрице. Но у малого числа циклов есть обратная сторона- выкокий бекграунд от исходной матрицы. тут то и появилось DpnI щепление. весь исходник крошится в мелкий венегрет, а мутантный ПЦР не страдает. Нет метилирования.
Теперь следите за руками. Для Квикченьжа в принцыпе можно брать РАЗНЫЕ термостабильные полимеразы. Почему японцы выбрали KOD? Ну тут, вероятно вопросы логистики. Может у вашего шефа дядя работает на КОДном складе. Вот и шлет он этот гуталин кому попало.
Что меняется в протоколе? Прежде всего буфер для помимеразы. Разная ионная сила - слегка могут варьировать температуры отжига праймеров. Но влияние незначительное и в принцыпе им можно принебречь. Далее скорость полимеризации. Тут надо или уменьшать или увеличивать время полимеризации. В зависимости от свойст полимеразы. Квикченьж в отличии от других методик не чувствительна к трансферазной активности полимеразы (если она вдруг имеется). И это ХОРОШО. Вам не набо беспокоиться, что полимераза навесит вам на концы лишнии А. Из за этого или лигирование ингибируется или лишние буквы в сиквенсе возникнут.
В общем ваши коллеги взяли стандартную КвикЧеньж методику и адаптировали его к той полимеразе, которая у ние есть. Такой метод вполне корректен. Родной протокол мутагенеза для KOD АБСОЛЮТНО другой. Прежде всего для него нужен совсем другой дизайн праймеров, который подразумевает ОБЯЗАТЕЛЬНОЕ лигирование ПЦР продукта.
Какие недостатки у Квикченьжа. Обычно длинные праймеры. Но поскольку сейчас синтез олигов стал дешев, на это можно не обращать внимание.
Вроде ничего не упустил.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): NMR-guy
Участник оффлайн! Sergeant
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 10.05.2016 12:54     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #63 множественное цитирование

Блин, мысль бежит впереди русской граматики. опечатки лезут как случайные ошибки полимеразы. smile.gif сорри

Всего благодарностей: 2Поблагодарили (2): Mila san, Esya
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 10.05.2016 13:21     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #64 множественное цитирование

подписываюсь, Квикченйдж отличный протокол, всегда все работает на ура.
Делаю с Pfx от инвитроджена, DpnI от ферментас, и самодельными компетешками.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): NMR-guy
Участник оффлайн! Sergeant
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 10.05.2016 13:42     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #65 множественное цитирование

Мой вариант:
Pfu DNA Polymerase от Стратаджене
DpnI от Ферментаса
Компетешки DH5$ \alpha $ эффективности обычного клонирования от Инвитроджена.(в тяжелых случаях библиотечной эффективности)
Контроль -Вайтскрип от Стратаджене.
guest: NMR-guy
IP-штамп: frJIZiDcZtEKs
гость



 прочитанное сообщение 10.05.2016 14:18     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #66 множественное цитирование

Отличный набор, это по сути и есть кит.
Участник оффлайн! Mila san

Japan



 прочитанное сообщение 10.05.2016 14:28     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #67 множественное цитирование

(Sergeant @ 10.05.2016 13:46)
Ссылка на исходное сообщение  Буду танцевать от печки. В случае топикстартера рекомендую посидеть часок под цветущей сакурой.
Метод сайт-направленного мутагенеза прежде всего определяется дизайном ПРАЙМЕРОВ. Все остальное уже вторично. У вас действительно КвикЧеньж. Главная его идея использование двух взаимно-комплиментарных праймеров. Мутация вносим в середину праймеров. Условно каждый праймер можно рассматривать как комбинацию из двух комплиментарных праймеров- правого и левого плеча, которые соединены между собой некомплиментарным спейсером. Если принять такую условность то очень просто подбирать мутантные праймеры. можно даже написать простенький скрипт, который будет делать это автоматически, что минимизирует ошибки. Ну или воспользоваться онлайн/офлайн совтом если уж совсем алгаритмически безграмотны.
В чем приемущества Квикченьжа? Быстро, нет стадии лигирования ПЦР продукта. Для лигирования нужны фосфатные группы на 5' конце. Поэтому и киназная реакция не тоже нужна. Число циклов амплификации 12-16. За такое число циклов число ошибок полимеразы не велико. Вам же не нужны спонтанные мутации рассыпаные по всей матрице. Но у малого числа циклов есть обратная сторона- выкокий бекграунд от исходной матрицы. тут то и появилось DpnI щепление. весь исходник крошится в мелкий венегрет, а мутантный ПЦР не страдает. Нет метилирования.
Теперь следите за руками. Для Квикченьжа в принцыпе можно брать РАЗНЫЕ термостабильные полимеразы. Почему японцы выбрали KOD? Ну тут, вероятно вопросы логистики. Может у вашего шефа дядя работает на КОДном складе. Вот и шлет он этот гуталин кому попало.
Что меняется в протоколе? Прежде всего буфер для помимеразы. Разная ионная сила - слегка могут варьировать температуры отжига праймеров. Но влияние незначительное и в принцыпе им можно принебречь. Далее скорость полимеризации. Тут надо или уменьшать или увеличивать время полимеризации. В зависимости от свойст полимеразы. Квикченьж в отличии от других методик не чувствительна к трансферазной активности полимеразы (если она вдруг имеется). И это ХОРОШО. Вам не набо беспокоиться, что полимераза навесит вам на концы лишнии А. Из за этого или лигирование ингибируется или лишние буквы в сиквенсе возникнут. 
В общем ваши коллеги взяли стандартную КвикЧеньж методику и адаптировали его к той полимеразе, которая у ние есть. Такой метод вполне корректен. Родной протокол мутагенеза для KOD АБСОЛЮТНО другой. Прежде всего для него нужен совсем другой дизайн праймеров, который подразумевает ОБЯЗАТЕЛЬНОЕ лигирование ПЦР продукта.
Какие недостатки у Квикченьжа. Обычно длинные праймеры. Но поскольку сейчас синтез олигов стал дешев, на это можно не обращать внимание.
Вроде ничего не упустил.


Спасибо за столь полное разъяснение, с праймерами все в порядке, построены с учетом QuickChange, сперва ставлю в 10 мкл для подбора оптим температуры отжига...те готовлю на 50, а затем уже по 10, соответственно 5 разных температур...после этого форезю и ничего не вижу....японцы очень настаивают, что им компания разработчик ПЦР-реакции настоятельно сказала делать форез до DpnI, хотя в методике написано, что на данном этапе либо будет визуализироваться бэнд пцр-продукта, либо не будет... Проверила еще раз праймеры по содержанию GC, у одной пары 38%, но я не знаю..насколько это критично...и температура отжига у другой пары 73...вместо рекомендуемых 78 и более...
PS Под цветущей сакурой уже не посидеть, отцвела 2 недели назад...Hanami весело с лабой уже отмечали smile.gif
Участник оффлайн! Sergeant
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 10.05.2016 15:28     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #68 множественное цитирование

Про праймеры для Квикченджа.
Вспомнил старый хинт, может кто и не знает про него. Есть такая программа Симвектор от фирмы Премиербиософт. На хомяке есть демка
http://www.premierbiosoft.com/crm/jsp/com/...ProductList.jsp

сама програмама, так себе, не стоит своих денег. Но в демонстрационном режиме можно запустить полнофункциональный модуль для подбора праймеров квикченьжа.
Работает. Я так много праймеров сделал. Функционал программы премитивный, но если не нужно придумывать извратов, то сойдет для сельской месности.
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 10.05.2016 15:39     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #69 множественное цитирование

Отжиг всегда на 55 ставлю, оптимизировать даже и не пытался. Гонять форезы - бессмысленно.
Мне лень читать всю ветку, У вас в чем проблема? клоны не растут? или растут но не мутируются?
или вы не видя ничего не геле дальше не делаете? ибо помоему, в ките даже написано, что можете и не увидеть ничего.
Участник оффлайн! Esya
Постоянный участник
PA, USA



 прочитанное сообщение 10.05.2016 16:27     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес  ICQ
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #70 множественное цитирование

Девушка, возьмите НОВУЮ аликвоту dNTPs.

и вообще закажите их для себя, разаликвотьте и старайтесь размораживать не больше нескольких раз(1-3) для обычной амплификации и одного раза для мутагенеза

(осенило, когда размышляла на репликой тролля, что кит или не кит -- все едино, а у меня раз в 10-1000 разница в штуках колоний обычно без кита)
Участник оффлайн! Mila san

Japan



 прочитанное сообщение 10.05.2016 17:24     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #71 множественное цитирование

(ship @ 10.05.2016 16:39)
Ссылка на исходное сообщение  Отжиг всегда на 55  ставлю, оптимизировать даже и не пытался. Гонять форезы - бессмысленно.
Мне лень читать всю ветку, У вас в чем проблема? клоны не растут? или растут но не мутируются?
или вы не видя ничего не геле дальше не делаете? ибо помоему, в ките даже написано, что можете и не увидеть ничего.


Возвращаясь к началу, я сама никогда этим не занималась, учусь, точнее самообучаюсь, работаю в команде японцев, в их проекте, я так поняла, что им компания разработала под quick change и поставила реакцию...и, видно, сказали после амплификации делать форез...до меня девочка делала по прототипу и, видно у нее что-то форез показал, тогда они дальше потопали дорогой, стали делать трансформацию...и тд... На моем этапе ...я не получаю фореза после амплификации...для них это что-то невероятное, ведь вроде должно БЫТЬ!!! На что я им тоже указала в методике...что и не обязательно должно визуализироваться....но чем это объяснить, я тоже не знаю, тк я не профи, а только учусь.
Участник оффлайн! Mila san

Japan



 прочитанное сообщение 10.05.2016 17:28     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #72 множественное цитирование

(ship @ 10.05.2016 16:39)
Ссылка на исходное сообщение  Отжиг всегда на 55  ставлю, оптимизировать даже и не пытался. Гонять форезы - бессмысленно.
Мне лень читать всю ветку, У вас в чем проблема? клоны не растут? или растут но не мутируются?
или вы не видя ничего не геле дальше не делаете? ибо помоему, в ките даже написано, что можете и не увидеть ничего.


Простите, я забыла добавить....еще градиент температур подбирают от 51.7 до 68...поэтому видно и ожидают результаты фореза....хотя тут уже писали, что в вариации от 48 до 60 в любом случает точно отожгется все...
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 10.05.2016 21:01     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #73 множественное цитирование

(Mila san @ 10.05.2016 15:28)
Ссылка на исходное сообщение  Простите, я забыла добавить....еще градиент температур подбирают от 51.7 до 68...поэтому видно и ожидают результаты фореза....хотя тут уже писали, что в вариации от 48 до 60 в любом случает точно отожгется все...

это как в анекдоте, вам шашечки или ехать?
извращенцы ваши япошки, 68 отжиг , жесть, идиоты. хотя может конечно, вы не знаете всех деталей, того что они делают.

возьмите тайком трансформируете,после Dpn, если вырастет - то выделяйте плазмиду, и на сиквенс. ну еще посмотрите, что там с сайтами рестрикци до-после мутагенеза, иногда везет, и можно порезать, чтобы найти мутантов

Всего благодарностей: 2Поблагодарили (2): Esya, NMR-guy
Участник оффлайн! NMR-guy
Постоянный участник
временной жизни



 прочитанное сообщение 10.05.2016 21:15     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #74 множественное цитирование

(ship @ 10.05.2016 21:01)
Ссылка на исходное сообщение иногда везет, и можно порезать, чтобы найти мутантов

Даже если не везет - подработать немного 3'-концом праймера по точке - и повезет почти всегда wink.gif
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 10.05.2016 21:32     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #75 множественное цитирование

(NMR-guy @ 10.05.2016 19:15)
Ссылка на исходное сообщение  Даже если не везет - подработать немного 3'-концом праймера по точке - и повезет почти всегда wink.gif

не понял. мутация в середине праймера всегда.
Участник оффлайн! NMR-guy
Постоянный участник
временной жизни



 прочитанное сообщение 10.05.2016 22:26     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #76 множественное цитирование

Я думал ты про ПЦР-скрининг колоний праймерами фланкирующими область мутации с разрезанием мутантной точки в ПЦР-продукте скрининга рестриктазой. Типо если мутантная колония и все удалось - то продукт порежется. Если нет по какой-то причине - то не порежется. Или наоборот.

Чтобы время и деньги на сиквенс всех этих колоний зря не терять.
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 11.05.2016 00:57     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #77 множественное цитирование

я про порезать плазмиду, зачем тут скрининг? эффективность там всегда под 100%, максмимум 2-3 клона надо
Участник оффлайн! Mila san

Japan



 прочитанное сообщение 11.05.2016 13:38     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #78 множественное цитирование

(ship @ 10.05.2016 22:01)
Ссылка на исходное сообщение  это как в анекдоте, вам шашечки или ехать?
извращенцы ваши япошки, 68 отжиг , жесть, идиоты. хотя может конечно, вы не знаете всех деталей, того что они делают.

возьмите тайком трансформируете,после Dpn, если вырастет - то выделяйте плазмиду, и на сиквенс. ну еще посмотрите, что там с сайтами рестрикци до-после мутагенеза, иногда везет, и можно порезать, чтобы найти мутантов



Смотрите, в общем-то для всех 5-ти температур отжигается...это четыертый образец...но к четвертому образцу у меня были другие праймеры, не подобранные моим тьютором как для первых трех образцов.

Картинки:
16_05_11_4th.jpeg - кликните, чтобы открыть увеличенную картинку
16_05_11_4th.jpeg — (1.94мб)   



Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): NMR-guy
Участник оффлайн! Mila san

Japan



 прочитанное сообщение 11.05.2016 13:45     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #79 множественное цитирование

(Sergeant @ 10.05.2016 13:46)
Ссылка на исходное сообщение  Буду танцевать от печки. В случае топикстартера рекомендую посидеть часок под цветущей сакурой.
Метод сайт-направленного мутагенеза прежде всего определяется дизайном ПРАЙМЕРОВ. Все остальное уже вторично. У вас действительно КвикЧеньж. Главная его идея использование двух взаимно-комплиментарных праймеров. Мутация вносим в середину праймеров. Условно каждый праймер можно рассматривать как комбинацию из двух комплиментарных праймеров- правого и левого плеча, которые соединены между собой некомплиментарным спейсером. Если принять такую условность то очень просто подбирать мутантные праймеры. можно даже написать простенький скрипт, который будет делать это автоматически, что минимизирует ошибки. Ну или воспользоваться онлайн/офлайн совтом если уж совсем алгаритмически безграмотны.
В чем приемущества Квикченьжа? Быстро, нет стадии лигирования ПЦР продукта. Для лигирования нужны фосфатные группы на 5' конце. Поэтому и киназная реакция тоже не  нужна. Число циклов амплификации 12-16. За такое число циклов число ошибок полимеразы не велико. Вам же не нужны спонтанные мутации рассыпаные по всей матрице. Но у малого числа циклов есть обратная сторона- выкокий бекграунд от исходной матрицы. тут то и появилось DpnI щепление. весь исходник крошится в мелкий венегрет, а мутантный ПЦР не страдает. Нет метилирования.
Теперь следите за руками. Для Квикченьжа в принцыпе можно брать РАЗНЫЕ термостабильные полимеразы. Почему японцы выбрали KOD? Ну тут, вероятно вопросы логистики. Может у вашего шефа дядя работает на КОДном складе. Вот и шлет он этот гуталин кому попало.
Что меняется в протоколе? Прежде всего буфер для помимеразы. Разная ионная сила - слегка могут варьировать температуры отжига праймеров. Но влияние незначительное и в принцыпе им можно принебречь. Далее скорость полимеризации. Тут надо или уменьшать или увеличивать время полимеризации. В зависимости от свойст полимеразы. Квикченьж в отличии от других методик не чувствительна к трансферазной активности полимеразы (если она вдруг имеется). И это ХОРОШО. Вам не набо беспокоиться, что полимераза навесит вам на концы лишнии А. Из за этого или лигирование ингибируется или лишние буквы в сиквенсе возникнут. 
В общем ваши коллеги взяли стандартную КвикЧеньж методику и адаптировали его к той полимеразе, которая у ние есть. Такой метод вполне корректен. Родной протокол мутагенеза для KOD АБСОЛЮТНО другой. Прежде всего для него нужен совсем другой дизайн праймеров, который подразумевает ОБЯЗАТЕЛЬНОЕ лигирование ПЦР продукта.
Какие недостатки у Квикченьжа. Обычно длинные праймеры. Но поскольку сейчас синтез олигов стал дешев, на это можно не обращать внимание.
Вроде ничего не упустил.



Похоже, что праймеры....косячные, за программу спасибо, надо мне с ней посидеть...посмотрите форез, на нем 3 образца подряд, для каждого градиент температур от 51, 55, 60, 64, 68 соответственно. С последним образцом все получилось, но к нему праймеры уже были еще созданные другим сотрудником, не моим тьютором...работала на льду, пока готовила ПЦР реакцию.

форез матрицы тоже прикрепляю...там по 2 матрицы результаты, тьютора и мои.

Картинки:
16_05_11_3samples.jpeg - кликните, чтобы открыть увеличенную картинку
16_05_11_3samples.jpeg — (1.88мб)   

16_05_11_templateDNA_phoresis.jpeg - кликните, чтобы открыть увеличенную картинку
16_05_11_templateDNA_phoresis.jpeg — (1.86мб)   



Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): NMR-guy
Участник оффлайн! Sergeant
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 11.05.2016 15:31     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #80 множественное цитирование

Тут я подумал и решил, что фигню написал с программой. mol.gif Мой совет был актуальным лет 8 назад. А сейчас нет смысла возиться с кривыми программами от Премиербиософта. mad.gif
Делайте все онлайн. Или на реинкарнации Стратаджене на хомяке Агилента
http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp
или на PrimerX
http://www.bioinformatics.org/primerx/cgi-bin/DNA_1.cgi

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Mila san
Участник оффлайн! NMR-guy
Постоянный участник
временной жизни



 прочитанное сообщение 11.05.2016 23:45     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #81 множественное цитирование

А еще лучше - на Primer BLAST-е. Но им сложнее пользоваться, как и любой сложноустроенной и абсолютно универсальной штукой.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

Судя по картинкам (если мастермикс был один для всех 4 образцов кроме самих образцов и праймеров), дело или в образцах и том что в них содержится, либо в пробирках со стоками праймеров или с тем, что в них содержится. Возьммите работающие праймеры и забудьте про потенциальных вредителей и пары неработающих стоков.

Оптимум отжега довольно очевиден из картинок, единственное - попробовать бы его на большей статистике чем 2 маленькие серии по 4 точки.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Mila san
Участник оффлайн! Sergeant
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 12.05.2016 10:00     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #82 множественное цитирование

А мне вообще все не очевидно. Я вообще не вижу продуктов ПЦР. Короткие димеры праймеров вижу, а ПЦР в упор нет. Как можно чтото оптимизировать если реакцию невозможно идентифицировать? Может я к старости уже в маразм впадаю?
Участник оффлайн! Mila san

Japan



 прочитанное сообщение 12.05.2016 10:40     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #83 множественное цитирование

(Sergeant @ 12.05.2016 11:00)
Ссылка на исходное сообщение  А мне вообще все не очевидно. Я вообще не вижу продуктов ПЦР. Короткие димеры праймеров  вижу, а ПЦР в упор нет. Как можно чтото оптимизировать если реакцию невозможно идентифицировать?  Может я к старости уже в маразм впадаю?



Почему? КАртинка с 4th sample названием....там видно, что наработаны ПЦР-продукты...при разных температурах при 51,7, 55.7, 60, 64, 68. Разве нет??? Как вообще можно правильно визуализировать результаты фореза? Есть какие-то рекомендации??? Заранее благодарна
Участник оффлайн! Mila san

Japan



 прочитанное сообщение 12.05.2016 10:42     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #84 множественное цитирование

(Sergeant @ 12.05.2016 11:00)
Ссылка на исходное сообщение  А мне вообще все не очевидно. Я вообще не вижу продуктов ПЦР. Короткие димеры праймеров  вижу, а ПЦР в упор нет. Как можно чтото оптимизировать если реакцию невозможно идентифицировать?  Может я к старости уже в маразм впадаю?


А на картинке 3samples - там как раз три образца подряд....но ничего не отожглось....или я неправильно думаю и вижу?
Участник оффлайн! Sergeant
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 12.05.2016 11:21     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #85 множественное цитирование

У вас должен быть ПЦР продукт размером ИСХОДНОЙ плазмиды. ПЦР на такой матрице обычно деффузная полоса. Сравните полосы исходной плазмиды и вашу "оптимизацию". Как вас уже предупреждали, после 14 циклов можно ничего и не увидеть. Или мы не знаем как-то деталей?
Зачем вы гель пленкой закрываете? Без пленки видно явно лучше. Что за маркер у вас? Форез какой-то хилый. Отожглось или нет сказать сложно. Праймеры в ОГРОМНОМ избытке по отношению к исходной матрице. Даже когда идет ПЦР жирной полосой, Квикченьж проймеры всегда видно. Это же длинные дуплексы.
16_05_11_4th.jpeg- ПЦР есть. Все отлично. Во всяком случае с амплификацией.
Участник оффлайн! NMR-guy
Постоянный участник
временной жизни



 прочитанное сообщение 12.05.2016 12:01     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #86 множественное цитирование

Не слушайте тов. Сержанта, это все придирки. Все понятно по результатам - праймеры не работают или образцы "3 образца подряд" имеют почти нулевую концентрацию изначально (шаблон этих образцов).
Участник оффлайн! Sergeant
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 12.05.2016 12:26     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #87 множественное цитирование

Не слушайте тов. Магнитно-Резонанщика. Эти физики только в шестидесятых годах что то путное на благо биологии делали. smile.gif

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): NMR-guy
Участник оффлайн! Mila san

Japan



 прочитанное сообщение 12.05.2016 12:27     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #88 множественное цитирование

(Sergeant @ 12.05.2016 12:21)
Ссылка на исходное сообщение  У вас должен быть ПЦР продукт размером  ИСХОДНОЙ плазмиды. ПЦР на такой матрице обычно деффузная полоса. Сравните полосы исходной плазмиды и вашу "оптимизацию". Как вас уже предупреждали, после 14 циклов можно ничего и не увидеть. Или мы не знаем как-то деталей?
Зачем вы гель пленкой закрываете? Без пленки видно явно лучше. Что за маркер у вас? Форез какой-то хилый. Отожглось или нет сказать сложно. Праймеры в ОГРОМНОМ избытке по отношению к исходной матрице. Даже когда идет ПЦР жирной полосой, Квикченьж проймеры всегда видно. Это же длинные дуплексы.
16_05_11_4th.jpeg- ПЦР есть. Все отлично. Во всяком случае с амплификацией.


У меня вопрос: почему после 14 циклов можно и не увидеть ПЦР-продукт, его не достаточно для визуализации, примерно с какого тогда цикла можно точно видеть...с 20??????
Участник оффлайн! NMR-guy
Постоянный участник
временной жизни



 прочитанное сообщение 12.05.2016 12:36     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #89 множественное цитирование

Если Вы рабочими праймерами из 4-го образца (их рабочесть см. 16_05_11_templateDNA_phoresis.jpeg — (1.86мб)) напцрили шмеры с матриц первых трех образцов (см. Y167A.jpeg — (1.8мб)), при этом праймеры к этим образцам как видно из геля (см. 16_05_11_3samples.jpeg — (1.88мб)) не работая по шаблону находились в образце в значительном избытке, вывод только один: беда может быть с самими шаблонами (образцами) 1-3. Если есть клеточный банк плазмид образцов 1-3 - вырастите урожай этих плазмид в среде с жесткими условиями а/б отбора, сделайте их мини/мидипреп и пробуйте свои старые праймеры снова.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Mila san
Участник оффлайн! Sergeant
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 12.05.2016 12:50     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #90 множественное цитирование

У меня вопрос: почему после 14 циклов можно и не увидеть ПЦР-продукт, его не достаточно для визуализации, примерно с какого тогда цикла можно точно видеть...с 20??????

Вы когда нибудь о ПЦР в реальном времени слышали? Все зависит от количества исходной матрицы. В реалтайме бывает на 14 цикле уже продукта море, а бывает и 35 цыклов мало. Только в отличии от Реалтайма в мутагенезе условия УЖАСНЫЕ.
В реалтайме апликон 200 нуклеотидов, а у нас по 4-7кв.
В реалтайме праймеры оптимезированы, а у нас как карты лягут. Между собой комплиментарные, да еще бывают и сами на себя липнут и шпильки дают. Поэтому никакого удвоения/на цикл в Квикченьже нет. Я уже лет 15 этим протоколом пользуюсь и каждый раз поражаюсь, что это все работает.
беда может быть с самими шаблонами (образцами) 1-3. Если есть клеточный банк плазмид образцов 1-3 - вырастите урожай этих плазмид в среде с жесткими условиями а/б отбора, сделайте их мини/мидипреп и пробуйте свои старые праймеры снова.

Я бы праймеры переделал. Здается мне что и в них тоже дело.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): NMR-guy
Участник оффлайн! Sergeant
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 12.05.2016 12:54     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #91 множественное цитирование

Гели я не пленкой накрываю, а наоборот на пленку их выкладываю и форезю....такая у них методика....

Я заинтригован. Никогда про такое не слышал. Расскажите как это японцы форезы гоняют на пленке. Можно и фотографии показать чудо-девайса.
Участник оффлайн! Sergeant
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 12.05.2016 17:35     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #92 множественное цитирование

Я получил по ушам от модератора за флуд. Лишний раз убеждаюсь, что ни одно доброе дело не остается безнаказанным.smile.gif Посему умолкаю. Пусть теперь ППГ дает советы.smile.gif

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): NMR-guy
Участник оффлайн! R.J.Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 12.05.2016 19:09     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #93 множественное цитирование

вы не одиноки, модеры следят за всякой фигней, а уродов реально никто не банит. Ща договорюсь, будет еще один фол- у каждого свои развлечения, модеры-бездельники тоже отдыхать должны душой и телом. И телом?
Участник оффлайн! NMR-guy
Постоянный участник
временной жизни



 прочитанное сообщение 12.05.2016 23:43     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #94 множественное цитирование

Ааа, так вот за что мне фол достался тоже.

Ну, довыпендриваются они - если за наше общение в этой теме стали давать фолы - тут реально та же беда что и в Беседе скоро начнется. Какие модеры - такая и украина вокруг будет.
Участник оффлайн! Mila san

Japan



 прочитанное сообщение 13.05.2016 09:15     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #95 множественное цитирование

Ребята, сегодня сходила к профессору с тьютором, это, канеш цирк Шапито, но, как оказалось, тьютор подсунул мне не те стоковые плазмиды...для первых трех образцов...абсолютно другого штамма E.coli...профессор разглядел в одном из моих отчетов сегодня...Вот и вся комедия. Тьютор получил по шапке.
Guest
IP-штамп: frkbFHTMHbKpg
гость



 прочитанное сообщение 13.05.2016 10:03     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #96 множественное цитирование

Да уж, неплохо так влетело!
Guest
IP-штамп: frkbFHTMHbKpg
гость



 прочитанное сообщение 13.05.2016 10:17     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #97 множественное цитирование

извините за слово на букву е... я честно являюсь Вашим клиентом
Участник оффлайн! NMR-guy
Постоянный участник
временной жизни



 прочитанное сообщение 13.05.2016 20:31     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #98 множественное цитирование

(Mila san @ 13.05.2016 09:15)
Ссылка на исходное сообщение  Ребята, сегодня сходила к профессору с тьютором, это, канеш цирк Шапито, но, как оказалось, тьютор подсунул мне не те стоковые плазмиды...для первых трех образцов...абсолютно другого штамма E.coli...профессор разглядел в одном из моих отчетов сегодня...Вот и вся комедия. Тьютор получил по шапке.

В общем, как я и предполагал, это вполне мог быть умышленный саботаж. mad.gif

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Mila san
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 14.05.2016 02:32     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #99 множественное цитирование

(NMR-guy @ 13.05.2016 21:31)
Ссылка на исходное сообщение  В общем, как я и предполагал, это вполне мог быть умышленный саботаж.  mad.gif

А сколько было "ценных" советов! lol.gif lol.gif lol.gif
Ради справедливости, советы Сержанта были по делу, от пользователя. yes.gif

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Mila san
Участник оффлайн! NMR-guy
Постоянный участник
временной жизни



 прочитанное сообщение 14.05.2016 10:06     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

Ради чего-чего? lol.gif

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 09.12.21 10:03
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft