molbiol.ru -> CRISPR-Cas9

> Все форумы > Тематические форумы > Молекулярная и клеточная биология

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ

Правила FAQ* Поиск* Участники* Календарь* Избранные темы* Форум Форумов*

Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ]

Форум:

* CRISPR-Cas9 -- запутался в трех соснах --

Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.

Sergeant
Постоянный участник

19.10.2016 14:41

URL #1

Вводная:
Делаю лентивирусы, экпрессирующие Cas9 и гайдРНК. Плюю их на человеческие клетки и смотрю на вестерне экспрессию целевого белка. Уменьшение есть, но хочется иметь полный нокаут. Клетки позитивные на инфекцию отбираю на пуромицине.
Что бы разобраться в эффективности нокаута делаю Т7 мисматч тест. Вроде инделы есть.
Вопрос:
Хочу сделать клональную селекцию после инфекции. Как отбирать наилучшие клоны? Только Вестерном? Ведь в геноме две копии хромосомы и соответственно две копии моей мешени. Если нокаут идет только по одной хромосоме, то на сиквенсе сенгером я получи кашу от разных аллелей. Это если сразу сиквенировать участок в окрестностях мешени. А если сначала клонировать фрагменты ПЦР то на сиквенсе в разных бактериальных клонах будут разные аллели.
Как подбирать праймеры для ПЦР, что бы разобраться в разных вариантах:
1. Нет нокаута целевого гена (или есть оффтагет эффект)
2. Нокаут только по одной аллели
3. Полный нокаут. Как я понимаю у каждой аллели можент быть свой набор инделов.
Вариантов полногеномного сиквенирования не предлагать. Это, безусловно, информативно, но уж больно дорого.

Serpent
Постоянный участник
RU-->IT

19.10.2016 17:05

URL #2

Можно отбирать клоны на основе ПЦР с геномной ДНК.
При этом можно подобрать 2 гРНК так, чтобы 2 разрыва приводили к делеции достаточно большого куска днки, чтобы разницу видеть на форезе.

ship
Постоянный участник
Moscow

19.10.2016 17:52

URL #3

при выборе двух sgRNA для делеции большого куска у вас будут клоны без делеции, с моноаллельной делецией и делецией во обоих аллелях. затем нужный выбираете ПЦРом.

стр2287

Файл/ы:

Ran_FA_Nat_Protoc_2013.pdf
размер: 1.67мб
кол-во скачиваний: 267

Поблагодарили (1): NMR-guy

Sergeant
Постоянный участник

19.10.2016 17:56

URL #4

(Serpent @ 19.10.2016 15:05)

А можно схемку нарисовать? Как то не совсем понятно как большая делеция получается.

ship
Постоянный участник
Moscow

19.10.2016 18:03

URL #5

(Sergeant @ 19.10.2016 15:56)

А можно схемку нарисовать? Как то не совсем понятно как большая делеция получается.

см статью выше

Sergeant
Постоянный участник

19.10.2016 18:05

URL #6

(ship @ 19.10.2016 16:03)

см статью выше

Спасибо

Sergeant
Постоянный участник

19.10.2016 20:50

URL #7

Вроде начинаю понимать. Для большой делеции нужно брать никазную D10A версию Cas9 и два гайдРНК, которые берем в противоположных ориентациях.
С ПЦР все ясно. Праймеры фланкирующие делецию или комбинации out/in.
В моем случае в линтивирусе Cas9 дикого типа и только одна гайдРНК.
Ну Cas9 я легко поменяю мутагенезом, а что делать со второй РНК? Делать два разных вируса и коинфекцию? Слишком много новой возни. В моем случае делеции получаются небольшие и внутренних праймеров на них не сделать, а внешние дают продукт, который не разделится на агарозе, а городить длинные акриламидные гели геморой.
Начинаю завидовать владельцам сиквенаторов от Иллюмины.

РНК-сек и баркодинг были бы в тему.
Куда не глянь, а в моем случае самое простое/дешовое делать скрининг Вестерном.

ship
Постоянный участник
Moscow

19.10.2016 23:31

URL #8

ну у вас все вроде понятно - если белка нет - то два аллеля порезано, хорошо что можно блот делать.
а потом уже можно клоны и от ПЦРить и секвенировать по Сэнгеру, чтобы убедится.
по идее можно сделать один праймер на место делеции, другой внешний - с дикого типа и с одного аллеля будет ПЦРится, а если оба аллеля порезаны - то нет.

Flyamer
Постоянный участник
Москва

20.10.2016 14:59

URL #9

Если не вестерн и не next gen seq, то только клонирование ПЦР-продукта и секвенирование клонов, ИМХО. А вот если делать не просто разрез, а еще и делать HDR, то можно просто секвенировать ПЦР продукт, потому что тогда в случае разреза и починки на обоих хромосомах последовательность будет одинаковая.

Плюс есть вот эта штука, которая может решить все проблемы, но я не пробовал.
https://tide.nki.nl/

Поблагодарили (1): Sergeant

Sergeant
Постоянный участник

20.10.2016 17:09

URL #10

Плюс есть вот эта штука, которая может решить все проблемы, но я не пробовал.
https://tide.nki.nl/

Ценник впечатляет. И как то я сомневаюсь , что эта штука вообще может взлететь.
Но ПОПРОБУЮ.

то только клонирование ПЦР-продукта и секвенирование клонов

Пробовали. Теоретически Да. А практически нужно иметь целый взвод негров для клонирования и скрининга. Плохо масштабируемо.

С клональной селекцией тоже не так уж радужно. Долго. И не все клетки так резво делятся как 293.

Flyamer
Постоянный участник
Москва

21.10.2016 12:18

URL #11

Какой еще ценник? Это бесплатная штука (онлайн которая).

Причем здесь 293? Е. коли быстро делятся

Сообщение было отредактировано Flyamer - 21.10.2016 12:20

Sergeant
Постоянный участник

21.10.2016 14:13

URL #12

(Flyamer @ 21.10.2016 10:18)

Какой еще ценник? Это бесплатная штука (онлайн которая).

Причем здесь 293? Е. коли быстро делятся

1. Ну это я про лицензию для желающих прикрутить R скрипты на свой веб сервер.
Меня и бесплатный вариант устроит. Вот только есть небольшая проблемма.
Программа не работает ни с одного рабочего места. Серый экран и никаких признаков жизни. Пробовал дома. Там работает.

2. А причем здесь E.Coli? Я вроде бактериальный геном редактировать не собираюсь. Клонирование понятие универсальное. Бактериями не ограничивается.
В моей ситуации я плюю вирус на человеческие клетки. Потом давлю антибиотиком неифецированные клетки. Что получается? Получается компот из гомозиготных, гетерозиготных нокаутов. Плюс варианты с делециями, но активным белком. Плюс неспецифика. На вестерне в сумме все это дает падение экспессии до 30-50%. Меня КАТЕГОРИЧЕСКИ не устраивает.
Выход из ситуации- рассадить инфецированные клетки в 96 велочный планшет примерно по одной клетке на лунку. И ждать пока в лунках вырастут клоны. Если клетки шустро делятся тогда за 2-3 недели можно наростить клеток до товарного колличества и делать скрининг на этих клонах. А если клетки дохлые и ростут очень медленно, то до клонов можно и не дожить.

Flyamer
Постоянный участник
Москва

22.10.2016 01:31

URL #13

Да, они там пишут на сайте где-то, что бывают проблемы с доступом из-за фаерволов...

Да это я понимаю, что универсальное. Но ведь клонировать ПЦР-продукт из человеческих клонов надо будет в е коли, чтобы потом секвенировать. А то если в двух аллелях по-разному починился разрыв, опять же будет мешанина в сиквенсе.

Сообщение было отредактировано Flyamer - 22.10.2016 10:48

Esya
Постоянный участник
PA, USA

22.10.2016 03:32

URL #14

Но ведь клонировать ПЦР-продукт из человеческих клонов надо будет в е коли, чтобы потом секвенировать.

а зачем?

Flyamer
Постоянный участник
Москва

22.10.2016 10:49

URL #15

(Flyamer @ 22.10.2016 02:31)

А то если в двух аллелях по-разному починился разрыв, опять же будет мешанина в сиквенсе.

Flyamer
Постоянный участник
Москва

22.10.2016 11:30

URL #16

А в G2 в клетке хоть все 4 копи могут по-разному починиться, это совсем непойми что будет.

Конечно, может, этот TIDE все разберет, тогда это не нужно.

watchesbiz
Постоянный участник

24.11.2021 15:06

URL #17

https://jumpshare.com/v/QxZ9Rn2mfDCaBq2AdBG1
https://www.edocr.com/v/znnrba3z/watcheshut...lica-Watches-UK
https://www.tuugo.us/Companies/best-replica...s/0310006695505
https://topsitenet.com/article/988178-hints...ca-rolex-watch/
http://simp.ly/p/nxGlWb
https://telegra.ph/Hints-on-Choice-of-a-Hig...lex-Watch-02-22
https://replicarolexwatche2.blog.fc2.com/blog-entry-1.html
https://www.knowpia.com/s/blog_60f7e7c31014a97a
https://zenwriting.net/replicawatches24/hin...ica-rolex-watch
https://globalcatalog.com/replicawatchesuk.us/en
http://www.cplusplus.com/articles/iE1wvCM9/
https://eatsleepride.com/c/346210/hints_on_...ica_rolex_watch
https://www.myminifactory.com/users/watcheshutukcom
https://www.mioola.com/ReplicawatchesUK/post/199764/
https://en.gravatar.com/allreplicawatches24
https://8tracks.com/replicawatchesuk

nigoal123
IP-штамп: frAWeMdOsBSXM
гость

19.05.2022 06:44

URL #18

Anyone can connect บาคาร่าออนไลน์ with their audience slot xo through blogging and enjoy 11hilo you who your readers are. สล็อต the myriad benefits that 123GOAL blogging provides

organic traffic from nigoal from the first sentence.ลิงค์รับทรัพย์ search engines promotional พ ริ ต ตี้ เกม มิ่ง content for social media ราคา บอล and recognition from a new Hotgraph audience you haven’t tapped into yet.

guest: 123vega
IP-штамп: frAWeMdOsBSXM
гость

19.05.2022 10:43

URL #19

For the past 15 years, India Pggame123 and China have vied 88ktc for favourable diplomatic สล็อต123 and trade relations 123bets with Sri Lanka thanks 11hilo to its strategic location in the Indian หวยปิงปอง ocean. While popular perception สล็อต123 indicated China had outpaced India, the 123VEGA recent economic and Dreamgaming political turmoil in Sri Lanka seems to ปั่นสล็อต have given India's foreign policy.

Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.

Имя:

Отправка сообщений использует JavaScript операции. В вашем броузере не
установлено/отключено выполнение JavaScript программ. Используйте Netscape Navigator
или Internet Explorer (не ранее 3 версии); убедитесь, что выполнение JavaScript
программ разрешено в настройках вашего броузера.