 * |   |
|
Molbiol.ru | Project | Protocols | Programs | Literature Web | Companies | Marketplace | Labor exchange Today's active topics [ Log In* | Register* ] Forum: |
|
Rules
* Методы -- comments to a permanent page of the site --
Topic related to: Методы
Options: I want to be curator* · Track this topic* · Email this topic · Print this topic*
Topic view:* Outline · [ Standard ] · Linear+
   |
|
Guest IP-stamp: frXBaTONIry9A guest  |
 27.02.2009 12:33
|
|
Guest IP-stamp: frltbIKmJu36Q guest |
27.02.2009 14:03
вопросы у маня такие - сколько примерно мл крови нужно взять что бы выделить этот белок? достаточно ли 10 мл? - гепаринизация крови - подскажите или "ткните носом" в протокол сколько гепарина на мл крови - и осаждение феколом - тут вообще у меня опыта нет - сколько фекола, какие условия - если подкините методику или ссылкку на таковую буду крайне признательна Заранее спасибо за советы , подсказки и Ваши соображения |
|
Guest IP-stamp: frDQwa9k7riYg guest |
16.03.2009 08:12
Мы добавляли 40 мкл аптечного на 10 мл крови, а вообще есть вакутайнеры с гепарином - с зеленой крышечкой. Фиколл готовится из двух компонентов - собственно фиколла и урографина или верографина, плотность полученного растворчика д.б.1.077. Наливаете в пробирку фиколл (3 мл), а сверху НАСЛАИВАЕТЕ (чтоб не смешалось) 5-6 мл крови (иногда кровь разводят средой, но по мне так это дело вкуса) и на центрифужку - 1500 оборотов, 20 -30 минут (лучше попробовать сначала меньшее время, чтобы все нужное не попадало). Достаете из центрифуги и видите - над столбиком осевших эритроцитов и гранулоцитов желтоватый слой фиколла, потом белое кольцо клеток и слой плазмы. Осторожно собираете белый слой -это и есть клетки. Отмойте их обязательно не меньше 2 раз, поскольку фиколл токсичен. Удачи!! |
 PrivalovМосква, Санкт-Петербург |
22.03.2009 22:53
|
|
guest: ммм IP-stamp: frwHRv5zEzGDY guest |
24.03.2009 19:20
Попробуйте сначала растворить соль в 70% ДМФА, а потом уже в ПБС |
|
Guest IP-stamp: frsqCqXJdPw/M guest |
01.04.2009 07:36
|
|
Guest IP-stamp: frsqCqXJdPw/M guest |
01.04.2009 07:36
|
|
Umo4ka |
02.04.2009 10:21
Спасибо! |
|
guest: ммм IP-stamp: frwHRv5zEzGDY guest |
02.04.2009 11:13
|
|
Umo4ka |
02.04.2009 12:03
А механически не хочетсяиз-зипотерь. Ну разве что резиновым шпателем, как при сборе клеток. Так там сначала трипсин... Попробовать и мне трипсином что-ли? А если сплюнуть, кстати, то анализировать действительно можнодо посинения. Идеякакраз в том,что в разныхртахразное "садится" на зуб,хотя в слюне всепримерно одинаково. Так что "сплюн" меня как раз не интересует! Вернее интересует, но отдельно от пленки. 
|
|
guest: ммм IP-stamp: frwHRv5zEzGDY guest |
02.04.2009 14:11
Не выполнимое требование. --Больных, слав Богу нет, зубычистить некому, а кусочек зуба 5х5х1 мм на соответствующем носителе будет помещен зашеку на 3 мин. Вот с этим кусочком мне потом и играться.... Гы-гу га. Ну покипятите "Зуб" в 1%SDS может это вам поможет. |
|
Umo4ka |
06.04.2009 16:36
|
|
vvv2509 Advanced Member |
26.10.2009 13:40
|
|
Privalov Москва, Санкт-Петербург |
20.01.2010 00:45
Кто-нибудь работал над определением количества клеток, продуцирующих цитокины с помощью проточно Вся загвоздка в брефелдине-моненсине, добавляемого для блокировки транспорта цитокинов через мембрану. Вопрос - как разводить вещества (куплены в Сигме, сухие, инструкции НЕ прилагаются)??? |
|
Privalov Москва, Санкт-Петербург |
20.01.2010 00:49
Буду крайне признателен, если отзоветесь!!! Кто-нибудь работал с определением клеток, продуцирующих цитокины на проточном цитометре? Вся загвоздка в брефелдине-моненсине, блокирующих транспорт цитокинов через мембрану. Есть сухие, куплены в Сигме, инструкции НЕ прилагаются. Вопрос - КАК их разводить??? В чем??? Какие стоковые растворы??? Поделитесь, пожалуйста, информацией!!! 
|
|
Apis |
20.01.2010 15:45
Кто-нибудь проводил выделение ДНК из пчел и ее микросателлитный анализ? |
|
guest: ммм IP-stamp: frwHRv5zEzGDY guest |
22.01.2010 16:26
Кто-нибудь проводил выделение ДНК из пчел и ее микросателлитный анализ? Думаю кто-нибудь.... Да. |
|
Надежда-27 |
27.02.2010 12:26
Уважаемые коллеги, помогите решить такой вопрос: есть старые препаратыкрови, подготовленные для кариотипирования, препраты содержались при комнатной температуре; нужно сделать FISH, но реакция гибридизации не идет. Что нужно/можно сделать, чтобы исправить ситуацию, чтобы реакция пошла? Заранее благодарно! (если не туда приткнула вопрос - направьте в нужный раздел, пожалуйста.) |
|
guest: ммм IP-stamp: frCNCa5alkkCM guest |
27.02.2010 20:05
|
|
NBSC Advanced Member Петербург |
27.02.2010 20:39
(Privalov @ 19.01.2010 22:49)  Уважаемые коллеги!Буду крайне признателен, если отзоветесь!!! Кто-нибудь работал с определением клеток, продуцирующих цитокины на проточном цитометре? Вся загвоздка в брефелдине-моненсине, блокирующих транспорт цитокинов через мембрану. Есть сухие, куплены в Сигме, инструкции НЕ прилагаются. Вопрос - КАК их разводить??? В чем??? Какие стоковые растворы??? Поделитесь, пожалуйста, информацией!!! смотри сюда - - это брефелдин - это моненсин в обоих случаях слева есть ссылка на specification sheet. Смотрим туда и видим все, что нужно. Еще в чем проблема? Посчитать, сколько и чего разводить, надеюсь, сами сумеете? |
|
Надежда-27 |
28.02.2010 10:51
"Попротеазьте чем-нибудь ч ЭДТА конечно и тритоном что ли промойте" - Я не биолог, поэтому нечасто приходилось заниматься такими анализами (со старыми препаратами). Если Вас не затруднит, ответьте поподробнее: какой раствор надо использовать и сколько времени надо держать препараты в нем? Можно на мейл pln-33@mail.ru Заранее благодарна! This post has been edited by Надежда-27: 28.02.2010 10:58 |
|
studenttka |
28.02.2010 12:48
|
|
guest: ммм IP-stamp: frKx.BJzj62lY guest |
28.02.2010 14:33
Это бессмыслено. Универсального решения и подхода не существует. Могу только перечислить наиболее часто используемые ферменты. Трипсин, Протеиназа К, Проназа, Пепсин. По поводу оптимальных условий работы ферментов обратитесь к соответствующим справочным данным. По поводу времени обработки и концентрации фермента обсуждать это бессмысленно их надо просто подбирать. К тому же, как я написал выше, в результате может просто ничего не получиться. |
|
Liudmila IP-stamp: frpzMrmKUuRMg guest |
16.06.2010 00:17
|
|
Liudmila IP-stamp: frpzMrmKUuRMg guest |
16.06.2010 00:19
(Liudmila @ 16.06.2010 00:17) как приготовить окрашенный протеиновый маркер?Дорогие коллеги, Может ли кто-нибудь подсказать, как приготовить домашний окрашенный заранее протеиновый маркер? лаборатории Спасибо! Людмила. |
|
A Chemist Advanced Member Минск |
17.06.2010 22:38
Может ли кто-нибудь подсказать, как приготовить домашний окрашенный заранее протеиновый маркер? лаборатории заранее окрашенный? или заранее протеиновый? у Вас есть протеиновый маркер? смесь белков? и Вы хотите сделать его (ее) окрашенным? сами? какого цвета? купите NHS нужного красителя.... альтернатива: сделайте соль диазония из аминобензойной кислоты или купите Fast Black... и промодифицируйте смесь, предварительно ее подщелочив. напоследок обессоливание, т.е., удаление низкомолекулярных в-в This post has been edited by A Chemist: 17.06.2010 22:39 |
|
guest: ммм IP-stamp: fr.7YrlKGSBjc guest |
18.06.2010 10:03
Обычно раньше такие вещи делали порционовыми активными красителями с дихлортриазиновой группой. Только нужно помнить, что при покраске мол вес исходного белка может увеличится на несколько килодальтон в зависимости от мол веса красителя и числа связавшихся молекул красителя с белком. --промодифицируйте смесь, предварительно ее подщелочив. напоследок обессоливание, т.е., удаление низкомолекулярных в-в Угу, протокол примерно такой и есть. Также следует позаботится о том что бы в щелочном буфере для модификации отсутствовали вещества с первичными и вторичными аминогруппами(например трис) |
|
Liudmila IP-stamp: frpzMrmKUuRMg guest |
18.06.2010 21:48
|
|
guest: ммм IP-stamp: fr.7YrlKGSBjc guest |
18.06.2010 23:36
Как называется метод меченья антител FITC? Как называется метод коньюгации антител с пероксидазой? Как называется метод биотинилирования белка? Никак не называется .... ищете что-то на окраску белков активными красителями(проционами, цибкарбонами) |
|
АннБелла |
30.06.2010 14:24
|
|
guest: ммм IP-stamp: frwHRv5zEzGDY guest |
30.06.2010 16:23
Помню, что, стекла(блок) пред заливкой предварительно грели в термостате. ПСА и ТЕМЕД вроде клали во много раз меньше. Но я вам рекомендую воспользоваться волшебным полисахаридом, который есть у genseq'a. Его можно добавить в агарозный гель и у него удивительным образом повышается разрешение особенно для малых фрагментов.
|
|
АннБелла |
01.07.2010 14:22
 В принципе, фрагменты не такие малые, чтобы их не видеть. Видится всё, что надо. И делится хорошо. Проблемы иного плана, чисто "механические". Ну, и немного, наверное, по режиму самого фореза. |
|
RJ Dio Advanced Member |
02.07.2010 14:08
(guest: ммм @ 30.06.2010 17:23) Могу дать адрес вконтакте человека, котрый в юности этим баловался. Помню, что, стекла(блок) пред заливкой предварительно грели в термостате. ПСА и ТЕМЕД вроде клали во много раз меньше. Но я вам рекомендую воспользоваться волшебным полисахаридом, который есть у genseq'a. Его можно добавить в агарозный гель и у него удивительным образом повышается разрешение особенно для малых фрагментов. волшебный полисахарид имеется не только у генсека, но и в свободной продаже за бугром, 100 гринов за 100 г |
|
genseq Advanced Member |
04.07.2010 13:32
(RJ Dio @ 02.07.2010 12:08) волшебный полисахарид имеется не только у генсека, но и в свободной продаже за бугром, 100 гринов за 100 гНазывается это чудо "SYNERGEL". Способ получения запатентован 20 лет назад. Сейчас продаётся и перепродаётся многими фирмами. Сначала хотел сделать аналог, но просто копировать стало скучно. В результате на сегодняшний день имеется 3 сорта ПГМ, из которых можно получать гели самого различного разрешения. ПААГ отдыхает! This post has been edited by genseq: 04.07.2010 13:32 Attached File(s)
|
Synergel_20Flyer.pdf|
АннБелла |
05.07.2010 11:12
В 2.6 % ПААГ я всё очень чётко и хорошо вижу Но гель 20*20 и толщина 0,75 - краситься очень весело. This post has been edited by АннБелла: 05.07.2010 11:15 |
|
АннБелла |
05.07.2010 11:25
|
|
genseq Advanced Member |
05.07.2010 12:42
(АннБелла @ 05.07.2010 09:12) И я одинаково чётко буду видеть полосы от 2280 до 863? И 2 280 хорошо разойдётся с 2 274 при этом? И как соотносить его процентность с процентностью ПААГ? Или всё по вложенной инструкции к нему? В 2.6 % ПААГ я всё очень чётко и хорошо вижу Но гель 20*20 и толщина 0,75 - краситься очень весело.Чёткость нормальная, но насчёт разделения 2280 и 2274 не уверен. Нужно пробовать с большим пробегом, а мы гоняем исключительно на коротких дистанциях, в толстых гелях (4мм) и в горизонтальных камерах. На вертикальных тонких гелях картинки должны получаться чётче. Что касается разрешения, то для Ваших целей может подойти ПА-2 (0,8% агарозы + 0,6% ПГМ-1). На картинке показан форез маркёров М50, М100 и М200 на геле ПА-4 (ПА-2 + 1% ПГМ-2) , имеющем не самое высокое разрешение. Левая дорожка - лямбда (рестрикты HindIII). Для сравнения рядом разделение тех же рестриктов на 0,7% агарозе (видна парочка 2027 с 2322 и 564, а все крупные фрагменты на малом пробеге не делятся). Мочевину не пробовали, но на агарозных гелях с мочевиной люди работают, а на полигалактоманнан она влиять не должна. Если нужна инструкция по добавлению ПГМ, то напишу, но мне проще сварить гель самому. Можем поставлять гели не в готовом к употребления виде (с лунками), а в полипропиленовых стаканах. Остаётся разогреть в микроволновке и залить прибор. This post has been edited by genseq: 05.07.2010 12:46 Attached image(s)  ПА_4_форез_маркеров.JPG — (19.98k) |
|
АннБелла |
05.07.2010 13:49
Хорошо видны нижние фрагменты 982 и 863. Неплохо в серединке разделились 1410, 1497 и 1701. А вот 2280, 2274 и 2151 идут, естественно в таком проценте одной полосой. В просто АА (процент от 2,6 до 3,0) разгоняется великолепно и чётко абсолютно всё. Но красить эти гели....... На вашей картинке я вижу, что фрагменты меньше 2000 я буду видеть очень плохо, или же придётся перегружать лунки, тогда большие фрагменты будут сливаться. И разница у близкоидущих полос слишком велика, 2280 и 2 274 не разделяться точно... В 0,7-0,8% агарозе тоже делали, мелкие не видны вовсе. Про длину пробега тоже мысль была. Одна из первых Гоняли в большой горизонтальной камере - ничего подобного! Не разбегаются, так и идут табуном по всей длине.This post has been edited by АннБелла: 05.07.2010 13:59 |
|
genseq Advanced Member |
05.07.2010 14:12
По поводу Вашего геля. Это очень плохо сфотографировано, или мочевина с агарозой дают такую мазню? |
|
АннБелла |
05.07.2010 14:22
|
|
АннБелла |
05.07.2010 14:26
|
|
genseq Advanced Member |
05.07.2010 18:38
Прежде всего, Вы должны иметь термостат на 40...45 градусов, поскольку все растворы должны быть тёпленькими. В расплав 1% агарозного геля вливаете требуемый объём концентрата акриламид/метиленбисакриламид (29:1). Персульфат и ТЕМЕД можно добавить перед самым смешиванием в агарозу, а ещё лучше персульфат в агарозу, а ТЕМЕД в акриламид (или наоборот). Добавлять их нужно в 4...5 раз меньше нормы. Главное - очень быстро и очень тщательно перемешать и тут же залить в прибор, который перед заливкой также лучше держать в термостате. Если заполимеризуется слишком быстро, то возьмите ещё меньше персульфата и ТЕМЕДа. Главное в этом деле - навык, а для его приобретения несколько гелей придётся испортить. |
|
АннБелла |
06.07.2010 13:01
В просто ПААГ, без агарозы отличие в 6N видно великолепно. Можно увидеть и меньше, исходя из того расстояния, которое видимо между фрагментами, отличающимися в эти 6N. А вот в смешанном геле полосы размываются, видны не очень чётко. Работаю по Остерману, а у него методика дана довольно размыто. Например, он рекомендует после застывания основного геля и срезания границы заливать сверху агарозу 0.3%, в которой формируются карманы. Ну не липнет она к основному гелю! С гребёнкой кусками выходит. Делала и 0.5% (как в основном геле) и 0,4% - вроде всё нормально, формируются карманы, пробы вносятся хорошо. Но после прокрашивания становится очевидно, что при прохождении границы гелей размывается оно на все ближайшие лунки. Делала верхний гель из ПААГ - та же история. Делала гели без мочевины - полосы очень нечёткие, хотя РНК растворена в формамиде и в геле присутствует ещё и SDS. Варьировала вольтаж и температуру - никакого эффекта. Обычно камера с гонющимся форезом у меня живёт в холодильнике. Пробовала без охлаждения - ещё больше размывает. В принципе, можно работать на ПААГ без агарозы - там нет вопросов, всё очень хорошо и замечательно. Кроме момента прокрашивания. Надо быть просто хирургом высшей квалификации, чтобы красить в серебре гель 20*20, 0.75мм и 2,6% ПААГ  ((
|
|
guest: ммм IP-stamp: frKx.BJzj62lY guest |
06.07.2010 13:31
Почему вы не заливаете гель и сразу гребенку в него,зачем такие сложности. --В принципе, можно работать на ПААГ без агарозы - там нет вопросов, всё очень хорошо и замечательно. Кроме момента прокрашивания. Надо быть просто хирургом высшей квалификации, чтобы красить в серебре гель 20*20, 0.75мм и 2,6% ПААГ (( Могу лишь посоветовать сделать много-много биса. Например 2% АА и 1% Биса |
|
genseq Advanced Member |
06.07.2010 13:43
Если винилтриэтоксисилан отсутствует, подойдёт и более распространённый АПТЭС (аминопропилтриэтоксисилан), но его нужно будет обработать ещё глицидилметакрилатом. Остаётся только добыть требуемые реактивы. Если Вы за бугром, то ничем не могу помочь. Если в Москве, то могу подсказать, где их можно купить. Если в Пущино, то заходите. Налью  .Успехов! |
|
guest: ммм IP-stamp: frKx.BJzj62lY guest |
06.07.2010 14:07
Стекол не напасешси. Уж лучше модифицировать ПЭТ пленку, или подложку из полистирола. Тогда проблема отдирания отпадет сама собой. |
|
АннБелла |
07.07.2010 16:02
А вы попробуйте хоть раз! )))) Поскольку агарозе в смешанном геле положено застывать раньше, чем ПААГ (отсюда и хитрости с подбором концентрации ТЭМЕД и ПСА), то и правильность приготовления такого геля подтверждается образованием характерной границы при застывании. Она напоминает шхеры и фьорды на карте Норвегии И если опустить гребёнку сразу (что, кстати, и делалось ради прикола), то весь этот сюр образуется вокруг зубцов. Старик Остерман про это предупреждает. До того, чтобы посмотреть, какие при этом будут полосы, мои приколы не не дошли Гели на стекле я красила. Это первое, что приходит в голову. Честно говоря, не очень понравилась степень прокрашивания. Но попробовать один раз "пришить его ковалентно" и возможно, подувеличить насыщенность растворов серебра и проявителя попробовать можно. И хочется посмотреть, потеряю я стекло после этого, или нет. Есть у меня парочка покоцаных, могу пожертвовать ради науки Если в Москве, то могу подсказать, где их можно купить. Если в Пущино, то заходите. Налью . Я в Питере В Пущино бывать доводилось, месяцок там жила В любом случае, спасибо всем за живейшее участие! This post has been edited by АннБелла: 07.07.2010 16:05 |
|
Liudmila IP-stamp: frpzMrmKUuRMg guest |
05.08.2010 18:05
Кто-нибудь определял уровень фосфорилирования белков вестерн-блоттингом? У меня методика упорно не работает: уровень фосфорилирования оказывается многократно ниже, чем должно быть. Обращаюсь с белками как для обычного вестерн-блота. Куда могут деться фосфатные группы? Спасибо за любые предположения! |
|
Tom1 Advanced Member |
05.08.2010 18:28
(Liudmila @ 05.08.2010 08:05) Дорогие коллеги, Кто-нибудь определял уровень фосфорилирования белков вестерн-блоттингом? У меня методика упорно не работает: уровень фосфорилирования оказывается многократно ниже, чем должно быть. Обращаюсь с белками как для обычного вестерн-блота. Куда могут деться фосфатные группы? Спасибо за любые предположения! 1. Что вы имеите ввиду говоря об уровне фосфорелирования???? Типа количественный анализ с помощью щестерна?????? 2. Чем красите??? просто антителами на белок????? или специфическими к фосфопептидам или же на фосфо-аминокилоты?????? 3. В когда получаите образцы ( до варки) в буфере присуствуют ингибиторы фосфотаз и какие??????? |
|
Liudmila IP-stamp: frpzMrmKUuRMg guest |
05.08.2010 19:16
1.Оцениваю увеличение фосфорилирования качественно, на глазок. 2.Использую антитела к фосфопептидам. 3. Да, присутствуют: использую апротинин, леупептин, ортованадат и PMSF. Несколько лет назад эта методика работала в этой же научной группе, а теперь в моих руках - не получается. Обнаружила в интернете, что в случае антител против фосфопептидов надо использовать БСА вместо молока на всех этапах обработки блота, а я использовала молоко в случае вторичного антитела. Неужели это имеет значение?! |
| « Next Oldest · Molecular and cellular biology · Next Newest » |
 |
· Викимарт - все интернет-магазины в одном месте · Доска объявлений Board.com.ua ·
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---
Helicon · Dia-m · InterLabService · Beckman Coulter · SkyGen · OPTEC · BIOCAD · Evrogen · Syntol · Bioline · Sartorius · Khimexpert · SibEnzyme · Tecan · Danies · NPP «TRIS» · Bialexa · FizLabPribor · Genotek · ATG Service Gene · Biogen-Analitika
Your forum · editor@zbio.net · Time is now: 19.04.24 02:47
Powered by Invision Power Board(Trial) v2.0.0 © 2024 IPS, Inc.