Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
igenetic Москва |
Амплифицирую плазмиду размером 4,5 кб с полимеразой Phusion HotStart Fermentas. Реакцию ставлю с двух фосфорилированных праймеров. Один прямой имеет с 3'-конца копмлементарные матрице 20 нуклеотидов и 20 нуклеотидов на 5'-конце некомплементарные. Обратный праймер полностью комплементарен части матрицы с tac-промотором, таким образом, что на его 5'-конце находится ТА-богатая область -10. Так вот. Реакция проходит, и при последующем лигировании плазмида зашивается в кольцо, НО. Почти во всех клонах содержится делеция со стороны R-праймера, где область -10. Как правило отсутствуют все 6 букв, иногда меньше. Этот праймер перезаказывала новый и переставляла реакции с разными температурами отжига. Загадка в том (повторюсь), что делеция в итоговой плазмиде только со стороны обратного праймера, в области -10. Может быть у вас есть какие-то мыли и рекомендации, как избежать такую делецию? Сообщение было отредактировано igenetic - 07.10.2019 17:26 |
guest: petr IP-штамп: frpzMrmKUuRMg гость |
Ну первое что приходит в голову, образование вторичной структуры на конце праймера или амплифицированной плазмиды. Если есть возможность, то я бы удлинил обратный праймер с 5`конца чтобы сделать этот конец более тугоплавким |
Herr Opsis |
|
Herr Opsis |
(guest: petr @ 14.10.2019 21:58) Посмотреть бы на обратный праймер... Ну первое что приходит в голову, образование вторичной структуры на конце праймера или амплифицированной плазмиды. Если есть возможность, то я бы удлинил обратный праймер с 5`конца чтобы сделать этот конец более тугоплавким вроде ни прямого ни обратного девушка не выставила |
Herr Opsis |
|
Herr Opsis |
|
Herr Opsis |
праймеры около 40 нт тяните на 70 дегризов |
Herr Opsis |
|
genseq Постоянный участник |
|
ship Постоянный участник Moscow |
если да, то делайте по quikchange протоколу с двумя комплементарными праймерами |
igenetic Москва |
(ship @ 15.10.2019 16:38) конечную цель манипуляций опишите. то есть задача какая? вставить в плазмиду 20 нуклеотидов? если да, то делайте по quikchange протоколу с двумя комплементарными праймерами Задача: просто замена 24 нуклеотидов |
igenetic Москва |
(genseq @ 15.10.2019 11:01) Если делетируется промотор, то причиной может быть штамм-реципиент. При отсутствии в нём репрессора усиленная транскрипция любого гена будет губительной. В результате при трансформации идёт селекция вариантов с повреждённым промотором. И не стоит полагаться на паспортные характеристики штамма-реципиента. Плазмида с репрессорным геном может теряться. Спасибо за мысль! Но в данном случае это исключено, потому что контрольные варианты прекрасно трансформируются и поддерживаются. |
ship Постоянный участник Moscow |
(igenetic @ 17.10.2019 13:09) Делайте по Qiukchange без вариантов. правда праймеры будут длинные. если у вас мало денег или плохо варят праймеры - то могут быть проблемы. кроме того, чтото мутировать в экспресионной плазмиде - идея не очень хорошая. Ибо после ПЦР у вас нет гарантии того, что гдето не случилась ошибка. Поэтому я бы вырезал целевой кусок из плазмиды по уникальным рестриктазам ,засунул бы его в любой стандартный вектор, и уже там вставлял 24 нуклеотиды, секвенировал, и потом обратно в конечную плазмиду. |
igenetic Москва |
(guest: petr @ 14.10.2019 21:58) Посмотреть бы на обратный праймер... Ну первое что приходит в голову, образование вторичной структуры на конце праймера или амплифицированной плазмиды. Если есть возможность, то я бы удлинил обратный праймер с 5`конца чтобы сделать этот конец более тугоплавким R-праймер 5' - 3' cattatacgagccgatgattaattg В данном случае этот праймер может быть таким и только таким. Увы, удлинить не могу |
igenetic Москва |
(ship @ 17.10.2019 16:17) Делайте по Qiukchange без вариантов. правда праймеры будут длинные. если у вас мало денег или плохо варят праймеры - то могут быть проблемы. кроме того, чтото мутировать в экспресионной плазмиде - идея не очень хорошая. Ибо после ПЦР у вас нет гарантии того, что гдето не случилась ошибка. Поэтому я бы вырезал целевой кусок из плазмиды по уникальным рестриктазам ,засунул бы его в любой стандартный вектор, и уже там вставлял 24 нуклеотиды, секвенировал, и потом обратно в конечную плазмиду. Вариант с такой сложной заменой через еще один вектор -- не подходит. Потому что вся задача и состоит в том, чтобы быстро менять эти 24нт, заказывая каждый раз только один F-праймер с различными 24нт. Про квикчендж сейчас почитаю, спасибо! |
guest: petr IP-штамп: frvKCqje1sDbE гость |
Вам надо сделать 2 ПЦр продукта с перекрывающейся областью (конец первого - перекрытие с началом второго этак на 20-25 нуклеотидов). Соответственно у Вас 4 праймера: FW для правого куска: 5`-6 букв + сайт рестрикции + комплементарная часть-3` Rev для правого куска: 5`-20-25по перекрытие + комплементарная часть-3` FW для левого куска: 5`-20-25по перекрытие (комплиментарно перекрытию Rev от правого праймера) + комплиментарная часть-3` Rev для левого куска: 5`-6 букв + сайт рестрикции + комплементарная часть-3` ПЦР: 1. ПЦРите правый и левый куски отдельно (если с плазмиды, то не надо больще 15 циклов делать) 2. смешиваете по 1 мкл из предыдущих ПЦР реакций и ПЦРите с внешними праймерами (тоже самое, 15 циклов - более, чем достаточно). Далее: Режете/клонируете. Удачи Вам! |
igenetic Москва |
(guest: petr @ 18.10.2019 07:06) Если не хотите через второй вектор, то или квыкчейндж, или смотрите по бокам от потенциального места замены уникальные рестриктазы и делаете мутагенез ПЦРом в 2 этапа. В результате ПЦРов у Вас будет "вставка" по этим рестриктазам с нужной Вам последовательностью. Вам надо сделать 2 ПЦр продукта с перекрывающейся областью (конец первого - перекрытие с началом второго этак на 20-25 нуклеотидов). Соответственно у Вас 4 праймера: FW для правого куска: 5`-6 букв + сайт рестрикции + комплементарная часть-3` Rev для правого куска: 5`-20-25по перекрытие + комплементарная часть-3` FW для левого куска: 5`-20-25по перекрытие (комплиментарно перекрытию Rev от правого праймера) + комплиментарная часть-3` Rev для левого куска: 5`-6 букв + сайт рестрикции + комплементарная часть-3` ПЦР: 1. ПЦРите правый и левый куски отдельно (если с плазмиды, то не надо больще 15 циклов делать) 2. смешиваете по 1 мкл из предыдущих ПЦР реакций и ПЦРите с внешними праймерами (тоже самое, 15 циклов - более, чем достаточно). Далее: Режете/клонируете. Удачи Вам! Спасибо! |
Asterix Постоянный участник |
Решили проблему перекодировав участок вокруг нуклеотида. Попробуйте, измените последовательность этих шести нуклеотидов так чтоб оно ни на что существенное не влияло. А вдруг сработает еще раз. |
igenetic Москва |
(Asterix @ 19.10.2019 00:54) Однажды мы имели такую проблему , ничего не помогало. Ровно один нуклеотид на конце вставки регулярно исчезал при клонировании ну и рамка считывания сдвигалась. Решили проблему перекодировав участок вокруг нуклеотида. Попробуйте, измените последовательность этих шести нуклеотидов так чтоб оно ни на что существенное не влияло. А вдруг сработает еще раз. Тоже классная идея, возьму на заметку! Спасибо!
|
sandy01 Постоянный участник |
|
HY IP-штамп: frNpECYifupYs гость |
|
HY IP-штамп: frNpECYifupYs гость |
|
HY IP-штамп: frNpECYifupYs гость |
|
HY IP-штамп: frNpECYifupYs гость |
|
HY IP-штамп: frNpECYifupYs гость |
|
HY IP-штамп: frNpECYifupYs гость |
If you have any problem you can visit our website |
HY IP-штамп: frNpECYifupYs гость |
|
HY IP-штамп: frNpECYifupYs гость |
|
HY IP-штамп: frNpECYifupYs гость |
.You can also set up an office with a 25-digit activation code. For more information, you should visit our website |
HY IP-штамп: frNpECYifupYs гость |
|
HY IP-штамп: frNpECYifupYs гость |
selection of products but to access a licensed version, you must have Office product key.After you exceed the free trial period, it becomes mandatory to purchase an Office setup product key.Are you looking for ways to activate your Xfinity Stream Beta App on Roku using the |
HY IP-штамп: frNpECYifupYs гость |
|
HY IP-штамп: frNpECYifupYs гость |
|
HY IP-штамп: frNpECYifupYs гость |
|
HY IP-штамп: frNpECYifupYs гость |
|
HY IP-штамп: frNpECYifupYs гость |
|
HY IP-штамп: frNpECYifupYs гость |
|
HY IP-штамп: frNpECYifupYs гость |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |