Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Almost |
Столкнулись с проблемой, не идет реПЦР из геля. Начну с начала. Ген x собран с нуля. Ставим пцр из лигированной смеси, на форезе яркий бэнд нужной длины плюс неспецифика-бледнее. Разводим пцр в 100 раз ставим репцр, на форезе яркий бэнд, неспецифики почти нет. Вырезаем нужный фрагмент (максимально быстро) -выделяем набором TF-ставим репцр из этой смеси, на форезе неспецифика по длине меньше гена, а нашего фрагмента нет! Миллион пцр ставили тк трансформация не проходила, решили разобраться в чем проблема, на форезе смеси лигированной плазмида+ген-есть, видимо не закольцованная. Есть мнение, что спирт (который идет как промывка у набора, хотя там не 96) скручивает концевые участки фрагмента, и возможно из-за этого не садятся праймеры. В пцр полимераза iproof bio rad, буферы, наборы свежие. Размер гена 1600 пн Сообщение было отредактировано Almost - 06.10.2018 18:36 |
Mykhaylo Постоянный участник Україна |
|
Almost |
(Mykhaylo @ 06.10.2018 20:16) Вырежьте, киньте в воду, и не морочьте себе голову выделениями. Ну можете заморозить-оттаить разок. А еще лучше поиграйтесь условиями с оптимизацией (банально с температурой отжига для начала) - пусть продукта будет меньше, но не будет необходимости резать из геля. Это сборка гена, неспецифики в любом случае будет тонна. А методика по заморозке не дает высокого выхода продукта для лигирования |
Mykhaylo Постоянный участник Україна |
|
R-J-Dio Постоянный участник |
|
R-J-Dio Постоянный участник |
Это новое слово в науке, Шнобелевкой попахивает |
genseq Постоянный участник |
В старину реакция оснований с альдегидами использовалась в формалиновом методе оценки радиационного повреждения ДНК. Чем она сильнее повреждена, тем быстрее реагирует с формалином. Скорость реакции оценивалась по увеличению пика поглощения на 260 нм. Вывод: не пейте этот спирт! |
R-J-Dio Постоянный участник |
Сообщение было отредактировано R-J-Dio - 07.10.2018 15:08 |
ship Постоянный участник Moscow |
что вы подразумеваете под "трансформация не проходит"? если не идет реПЦР - то скорее всего вы из геля вырезаете не то или гдето еще ошибка, а дело не в самой реакции. клонируйте и сиквенинируйте тот ПЦР продукт который у вас нормально ПЦРиться, это может многое прояснить. |
R-J-Dio Постоянный участник |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(Almost @ 06.10.2018 19:31) Доброго времени суток! Столкнулись с проблемой, не идет реПЦР из геля. Начну с начала. Ген x собран с нуля. Ставим пцр из лигированной смеси, на форезе яркий бэнд нужной длины плюс неспецифика-бледнее. Разводим пцр в 100 раз ставим репцр, на форезе яркий бэнд, неспецифики почти нет. Вырезаем нужный фрагмент (максимально быстро) -выделяем набором TF-ставим репцр из этой смеси, на форезе неспецифика по длине меньше гена, а нашего фрагмента нет! Миллион пцр ставили тк трансформация не проходила, решили разобраться в чем проблема, на форезе смеси лигированной плазмида+ген-есть, видимо не закольцованная. Есть мнение, что спирт (который идет как промывка у набора, хотя там не 96) скручивает концевые участки фрагмента, и возможно из-за этого не садятся праймеры. В пцр полимераза iproof bio rad, буферы, наборы свежие. Размер гена 1600 пн "Трансформация не проходила" означает, что у вас не идет лигирование. Встречный вопрос - неужели праймеры с гена используете, а не с плазмиды? Для таких тестов в хозяйстве нужно держать плазмидные праймеры. А ПЦР и элюция из геля это потом, в конце концов, как Ронни предлагает, после тренировок на кошках. |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(genseq @ 07.10.2018 10:28) Такие фокусы возможны. И именно из-за спирта. Он может содержать примеси ацетальдегида, который реагирует с аминогруппами оснований А и С. Реакция идёт быстро с однонитевой ДНК. У двунитевой реагируют только концевые основания, что приводит к медленному расплетанию концов. На форезе это расплетание можно не заметить, но при повторной ПЦР на такие концы праймеры не сядут. А если и сядут, то уже внутри ампликона, на неспецифичные участки связывания. В старину реакция оснований с альдегидами использовалась в формалиновом методе оценки радиационного повреждения ДНК. Чем она сильнее повреждена, тем быстрее реагирует с формалином. Скорость реакции оценивалась по увеличению пика поглощения на 260 нм. Вывод: не пейте этот спирт! Сразу видно - прожженный насквозь старый самогонщик - ацетальдегид, метанол, изопропанол, но самая гадость - изоамиловый спирт. |
Carbon Copy Постоянный участник So close no matter how far |
|
R-J-Dio Постоянный участник |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |