Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Ответ в Как валидировать очистку от ДНК рекомбинантного белка

Иконка сообщения*  [ Без иконки ]   Важно!   Вопрос   Информация     Обмен опытом   Шутка, забавная история     Поздравления, благодарности   Возмутительно!   Проблема   Картинки, фотографии
Введите имя

 [вст. закрывающие теги*

*


*



Смайлик: согласен Смайлик: не согласен Смайлик: улыбка Смайлик: пожалуйста, умоляю! Смайлик: помираю со смеху Смайлик: подмигивание Смайлик: подшучивать, дразнить Смайлик: смущение Смайлик: мне стыдно Смайлик: жуть! Смайлик: не понял Смайлик: закатывать глаза Смайлик: недовольство, огорчение Смайлик: рёв в три ручья Смайлик: злость Смайлик: супер Смайлик: умник Смайлик: чайник Смайлик: сходка Смайлик: Ура! Смайлик: не получается!
Перевод выделенного текста из латиницы в кирилицу. Текст в квадратных скобках '[]' не преобразуется

Пример: biologija -> биология [b] - полужирный шрифт

Пример: [b]полужирный[/b] [i] - курсив

Пример: [i]курсив[/i] [u] - подчёркнутый

Пример: [u]подчёркнутый[/u] [sup] - верхний индекс

Пример: температура 37[sup]o[/sup]C [sub] - нижний индекс

Пример: H[sub]2[/sub]O - вода [QUOTE] - применяется для цитирования чужих сообщений, цитата вставляется с небольшим отступом от края текста

Пример: [QUOTE]цитата[/QUOTE] [code] - форматирование как при вводе
Применяется для вывода теста как он есть, с предотвращением форматирования (автопереноса на новую строку), без интерпретации кодов форума и смайликов; вставляется с небольшим отступом от края текста.

Пример: 
[code]
программный код
	1 строка
	2 строка
[/code] [list] - список:
возможны опции: 1, a, A, i, I
[list] неупорядоченный; 
[list=1] нумерованный; 
[list=A] упорядоченный по буквам A-Z

Пример:
[list=1]
[*] первая строка;
[*] вторая строка;
[/list] Тег [hr] - горизонтальная разделительная линия

Пример: 
Абзац 1
[hr]
Абзац 2 [url] - гиперссылка

Примеры:
[url]www.ncbi.nlm.nih.gov[/url]
[url=http://www.ncbi.nlm.nih.gov/]NCBI[/url] [email] - ссылка на адрес электронной почты

Пример: [email]masha@mail.ru[/email] Тег [img] - рисунок
[img] - в строке;
[imgL] - выравнивание по левому краю; 
[imgR] - выравнивание по правому краю.

Пример:
[img]http://molbiol.ru/izo/rl.gif[/img] [ru] - только для русских читателей

Пример:
[ru]это увидят только те, кто использует русский интерфейс[/ru] [en] - только для английских читателей

Пример:
[en]это увидят только те, кто использует английский интерфейс[/en] [self] - текст виден только вам и администрации

Пример:
[self]это увидите только вы сами[/self]
[left] - выравнивание по левому краю

Пример: [left]текст слева[/left] [center] - выравнивание по центру

Пример: [center]текст в центре[/center] [right] - выравнивание по правому краю

Пример: [right]текст справа[/right] [just] - выравнивание по обоим краям

Пример: [just]выровненный текст[/just]

     размер сообщения / макс. размер:  / 15360


Последние 10 сообщений [ в обратном порядке ]
12 Отправлен 11.06.2022 10:34
  Saxon Mullins 123VEGA says she once had PRAGMATIC PLAY romantic dreams of what her 'first time' would ICONIC GAMING be like. In none was หวยปิงปอง she paralysed by fear in a Sydney ปั่นสล็อต alleyway, aged 18, with a 123GOAL man she had met only minutes earlier. Ms 88KTC Mullins has always maintained FC SLOT this incident - in 2013 - was rape. It spurred AMB CASINO her to push for legal 11HILO reform in Australia, after a long court battle ended with a judge finding the man involved did not realise she hadn't consented to sex.
guest: 123 Отправлен 09.06.2022 09:35
  Elon Musk has 123VEGA threatened to เกมสล็อต walk away from his JOKER GAMING $44bn takeover DREAMGAMING of Twitter, accusing เล่นสล็อต the social media company of "thwarting" his 11HILO requests to learn AMB CASINO more about its user base. In a letter filed FC SLOT with regulators, Mr Musk 88KTC said he was entitled 123GOAL to do his own measurement of spam accounts.
guest: 123 Отправлен 08.06.2022 12:57
  South Korea 123VEGA and the US launched WAZDAN eight missiles WM CASINO on Monday, in AFFILIATE response to a ลิงค์รับทรัพย์ volley of ballistic missiles fired by North Korea the 123GOAL previous day. It comes 88KTC as Pyongyang continues FC SLOT to escalate its AMB CASINO missile tests. South 11HILO Korea's president Yoon Suk-yeol.
guest: 123 Отправлен 31.05.2022 09:11
  SINCE LAUNCHING AMB CASINO HIS INVASION OF UKRAINE, RUSSIA'S FC SLOT PRESIDENT VLADIMIR PUTIN 88KTC HAS FACED AN UNPRECEDENTED 11HILO GLOBAL RESPONSE, FROM CULTURAL BOYCOTTS TO 123GOAL COUNTRIES RADICALLY 123VEGA TRANSFORMING THEIR ALLBET FOREIGN POLICIES. BUT THE สูตรสล็อต LONGER THE CONFLICT CANDY BURST GOES ON, THE MORE SIGNS THERE ปั่นสล็อต ARE OF DIVISIONS.
KCN Отправлен 11.12.2018 10:36
  Да, для тех кто сомневается в том, что HPLC пригодна для работы с белками, причем не только для аналитики но и минипрепаратива и даже препаратива:

1. The Handbook of Analysis and Purification of Peptides and Proteins by Reversed-Phase HPLC, the Grace Vydac Technical Support Group.
2. The Handbook of Analysis and Purification of Peptides and Proteins by Reversed-Phase HPLC Presented by Vydac (The Separations Group).
3. HPLC of Peptides and Proteins: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) Hardcover – December 15, 2003 by Marie-Isabel Aguilar
4. Руководства к колонкам Zorbax 300SB-C18, SB-C18, SB-300 C8, 300 SCX, ODS C18, Zorbax phenyl , GF-450, GF -250, Eclipse XDB-C18, TSK SP-5PW , TSK G3000SW, TSK CM-3SW, 4.6/9.4 mm и толще, толще... wink.gif
guest: great Отправлен 31.10.2018 16:27
  Superbly written article, if only all bloggers offered the same content as you, the internet would be a far better place.
http://www.techallabout.com
KCN Отправлен 24.10.2018 11:50
  Вот, собственно, ссылки по валидации очистки рекомбинантного белка от ДНК клеток хозяина.
Надеюсь, будут полезны тем, кто идет по этому тернистому пути.
Методики: qPCR в большинстве случаев, реже гибридизация с Р32 меченой ДНК, спектрофотометрия, преципитация ДНК белками.

USP
http://www.pharmacopeia.cn/v29240/usp29nf2...45_viewall.html
https://pdfs.semanticscholar.org/f62f/12df1...fcc40ce310a.pdf
https://www.liebertpub.com/doi/abs/10.1089/...journalCode=gen
http://www.pharmacopeia.cn/v29240/usp29nf2...45_viewall.html

USP 29, 1045, biotechnology-derived articles

EP
1.9.2.25 Residual Host Cell DNA (Characterization)

ICH
ICH Q6B Specifications , p 473, 2017.

FDA
http://www.analisa-scientific.com/march-2014-enewsletterar/
http://www.who.int/biologicals/Molecular%2...20April2005.pdf

NCBI
https://www.google.com/url?sa=t&rct=j&q=&es...wABLPwzKd1SrmEZ
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3235147/
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28426392
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24042121

RG
https://www.researchgate.net/publication/25...utical_products

Коммерческие решения и патенты
https://pdfs.semanticscholar.org/f62f/12df1...fcc40ce310a.pdf
https://patents.google.com/patent/WO2012028740A1/ar

WHO
http://www.who.int/biologicals/biotherapeu...19_Nov_2013.pdf
KCN Отправлен 11.10.2018 15:36
  Выбрал две минипрепаративные колонки с С18, хочу попробовать еще и на них. Если куплю их и что получится - отпишусь.

Choose:
80Å for < 4 - 5 kD
300Å for > 4 - 5 kD

1. Protein Separations
Reversed-Phase Columns C18
StableBond (80Å) Reversed-Phase HPLC Columns
ZORBAX StableBond Columns (80Å) Ordering Information
Semi-Preparative
9.4x250 mm,5 mkm,
880975-202

2.Protein Separations
Reversed-Phase Columns C18
ZORBAX StableBond (300Å) Column Ordering Information
Semipreparative
9.4x250 mm, 5 mkm,
880995-202

http://www.proquinorte.com/es/productos/cr...scargas/bio.pdf

Притом для пептидов и белков производители рекомендуют С18, фенилку считают менее подходящим вариантом. И система буфер1/буфер2+ацетонитрил %, с вариациями с ТФУ. А не 2М (NH4)2SO4/ddH2O и фенилка.
KCN Отправлен 11.10.2018 14:41
  Что касается работы с белками, с молекулярными массами 1- 50 кДа и более, не только с пептидами, привожу ссылки на документы производителя Agilent 1100 , колонки Zorbax:

https://www.agilent.com/cs/library/brochure...-2103EN_150.pdf
http://www.proquinorte.com/es/productos/cr...scargas/bio.pdf
http://quimica.udea.edu.co/~carlopez/hplc/...log-2011-12.pdf

Хорошие колонки для работы: 9.4 мм и 21.2 мм в диаметре - это минипрепаративные и препаративные колнки, позволяют очистить от 15 до 50 мг материи. НО: на прибор Agilent 1100 производитель НЕ рекомендует ставить колонки "толще" 9.4 мм, т.е. только минипрепаративные.
Ну, мне достаточно. Притом для пептидов и белков рекомендуют С18, фенилку считают менее подходящим вариантом.

P.S.:
Протокол чистки трипсином, может кому понадобится: 180 минут со скоростью подачи трисового буфера рН 7.4 0.15 мл/мин, инъекция трипсина ( до 1 мкг/мл), 100 мкл, температура 36С, колонка 4.7x250 мм.
Чиститься отлично, после трипсина можно промыть градиентом буфер/30% изопропанол, со скоростью 0.3 мл/мин, так как изопропанол очень вязкий, вымывает остатки трипсина и пептиды.
KCN Отправлен 08.08.2018 11:47
  FPLC чаще используется для белков, HPLC - для низкомолекулярных веществ. Но когда мне надо проанализировать пептиды или белки я так же использую HPLC. Например фибринопептиды А и В , методика по Henshen. Или к примеру b-beta-N-domen, alpha-C-region фибриногена. Это уже домены 14-12 кДа. Более того, белки можно выделить и отнести на масспектр. Для zorbax du pont instruments колонки с фенильной прививкой , оказалось возможным получать микрограммы очень чистых белков и пептидов из плазмы крови или из фибриногена после черновой очистки центрипрепом, FPLC , осаждением фибрина/фибриногена температурой 54-58C. Эти фракции можно не только анализировать на масспектре, но и колоть мышками для иммунизации. Так же неплохо почистился вышеуказанный рекомбинантный белок (54 кДа). Если важна чистота пептида или белка о примесей, отличающихся на пару аминокислот и дающих перекрестную реакцию на моноклонах - HPLC годный вариант, лучше чем FPLC. И если у вас этого белка очень мало - порядка микрограмм. В остальных случаях я использую FPLC.

Если колонка забивается белком, например остатками фибриногена, я обычно прокачиваю трипсином в соответствующем буфере, и оставляю в нем систему на ночь. Утром промывают и все работает. Больше всего мне нравится возможность различать белок на C18-C8-фенилке и других колонках этого типа при разнице в одну аминокислоту, даже незаряженную.
И связка HPLC-масспектр себя хорошо зарекомендовала. Для рекомбинантных пептидов и белков есть смысл ставить предколонку. Набивают ее при помощи FPLC packing chamber, если набить вручную высокое давление спрессует сорбент и будет пузырь с буфером. Пакующая камера позволяет не пускать сорбент в буфере через насос FPLC, а выдавливать его в колонку или предколонку как из шприца. Есть специальные аппараты для паковки колонок и предколонок, но они дороже чем пакующая камера и узкоспециализированны. В них нет особого смысла. Если предколонку забьет ДНК, ее можно отсоединить от колонки и промыть буфером с ДНКазой, оставив так же на ночь. Это я пока не пробовал.
Посмотреть тему (откроется в новом окне)

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 28.03.24 22:23
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft