molbiol.ru -> ИФА: антитела в сыворотке

> Все форумы > Тематические форумы > Молекулярная и клеточная биология

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ

Правила FAQ* Поиск* Участники* Календарь* Избранные темы* Форум Форумов*

Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ]

Форум:

* ИФА: антитела в сыворотке

Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.

hydrohinon7

31.03.2013 17:21

URL #1

Здравствуйте! Проблема в следующем:
Схема ИФА: антиген - забивка -разведенная сыворотка - антитела к IgG - TMB в качестве субстрата,
в качестве сравнения - ячейки без антигена с буфером -забивка - та же разведенная сыворотка и та же детекция.
В пустых ячейках (где антигена не было) в любом случае значения OD выше, чем в ячейках, на которой сорбирован антиген, причем с уменьшением разведения сыворотки значения становятся и там, и там выше, но в пустых ячейках значения все равно больше, чем в ячейках с антигеном.

Пробовались забивки молоко 3-5 %, BSA 2-3 %, желатин 2% с твином и без твина - картина не меняется. Сами антитела к IgG с забивкой не вяжутся, проверяли.
Антиген -белки 60 и 200 к ДА, плашки Microlon High binding.
Подкиньте, пожалуйста, идею, где ошибка и как так вообще может быть?

Сообщение было отредактировано hydrohinon7 - 31.03.2013 17:25

vb
Постоянный участник

31.03.2013 18:48

URL #2

а почему у вас отрицательный контроль - без сорбированного антигена? вообще-то обычно тоже сорбированные лунки используют, но либо пробу не добавляют, либо (что правильнее) добавляют сыворотку заведомо не содержащую искомые антитела.

hydrohinon7

31.03.2013 19:10

URL #3

С сорбированными лунками без добавления пробы у нас все хорошо - близкие к нулю.
А сывороток без искомых антител, к сожалению, нет, поэтому действуем по методике буржуйских коллег, которые довольно часто так делают.
"Microtitre plates were coated with antigen... Control wells were coated with PBS and all data were corrected by subtraction of these background values"
Но сейчас вопрос даже больше "почему так"?: в любом случае, после адекватной блокировки, вроде не должна пустая ячейка вязать больше. чем ячейка с антигеном.

птаха
Постоянный участник

31.03.2013 19:47

URL #4

>>С сорбированными лунками без добавления пробы у нас все хорошо - близкие к нулю

коньюгат садится прямо на ваш хай биндинг
попробуйте взять планшеты меньшей сорбционной емкости

hydrohinon7

31.03.2013 20:08

URL #5

конъюгат - в смысле сама сыворотка? антитела к IgG не садятся - проверяли.

guest: ммм
IP-штамп: frYCOZf7GhDHk
гость

31.03.2013 21:25

URL #6

У вас антитела сыворотки вяжутся неспецифично на белок забивки.
Какой у вас буфер для разведения сыворотки???!!!!

hydrohinon7

31.03.2013 21:35

URL #7

=)) Тот же, что и блокировка, и того % , и меньшего пробовали + всегда твин. Да. про антитела к BSA и молоку думали, но вот антитела к желатину как-то эту концепцию поломали.

Guest
IP-штамп: frQlBxj4iQSg.
гость

31.03.2013 22:46

URL #8

(hydrohinon7 @ 31.03.2013 21:35)

Вы разицу между специфично и не специфично понимаете?
Нету у вас там антител к забивке, ни к казеину, ни к BSA, ни к желатину.
И не надо писать про "Из того же материалу." Какая конкретно пропись буфера?
И еще вопрос: сыворотка у вас какого происхождения? От больного, вы ищете антитела на атиген вообще или тестируете сыворотку иммунизированного животного?

guest: ммм
IP-штамп: frQlBxj4iQSg.
гость

31.03.2013 22:56

URL #9

Пардон,это был я.

hydrohinon7

31.03.2013 22:57

URL #10

Разница ясна. (BSA 2% или milk 1 % или cold water fish skin gelatin 2 % )+ PBS+ Tween 0,05 % . Сыворотка больных.

птаха
Постоянный участник

01.04.2013 04:19

URL #11

>>С сорбированными лунками без добавления пробы у нас все хорошо - близкие к нулю
"забивку" Вы в этом случае делали?

>> антитела к IgG не садятся - проверяли.
расскажите как именно Вы это проверяли

guest: ммм
IP-штамп: frQlBxj4iQSg.
гость

01.04.2013 07:22

URL #12

1)Кстати, какой концентрацией антигена вы сенсибилизируете панель.
2)Такая хрень происходит со всеми сыворотками?

1. Разведите сыворотку побольше перед нанесением в 2-10 раз больше чем разводили раньше. Одновременно можно увеличить количество забивочного белка в буфере для разведения сыворотки относительно количества, использованного для забивки платы, раза в 2.
2.На будущее, когда вы забиваете плату белком ни в коем случае не добавляйте детергент(хотя я вижу что вы делали и так и так и не помогло).
3.После инкубации с сывороткой промойте плату 2 раза разными буферами.
Первый буфер 4х-кратный PBS. второй буфер 40мМ(фосфатный буфер или трис-HCl) с рН=7-7.5 и где-нибудь 0.2-0.5% Твин.

Panaev
Постоянный участник

01.04.2013 08:07

URL #13

(hydrohinon7 @ 31.03.2013 20:10)

Но сейчас вопрос даже больше "почему так"?: в любом случае, после адекватной блокировки, вроде не должна пустая ячейка вязать больше. чем ячейка с антигеном.

Не, ну если вам важнее шашечки, чем стабильно работающий метод, то можно продолжать упражнения.

А вот почему нельзя найти контрольную сыворотку без антител - для меня вопрос. Что за антиген такой секретный? И если у всех людей есть к нему антитела, то смысл их вообще определять?
Обычным ходом, если в популяции высокий процент серопозитивных людей, брать сывортки детей или даже новорожденных. В детских поликлиниках\больницах поспрашивайте.

Gizelle

01.04.2013 09:58

URL #14

Действительно, разводите сыворотки побольше! загадочное увеличение значений OD с увеличением разведения сывороток происходит по той причине, что в лунках, где сыворотки больше, в дальнейшем происходит ингибирование ферментативной реакции конечным продуктом. что-то вроде ретроингибирования, короче. чтокасается пустых лунок - плохо блокируете, как вариант.

Сообщение было отредактировано Gizelle - 01.04.2013 09:59

hydrohinon7

06.04.2013 15:20

URL #15

О! спасибо! 1 и 3 еще не пробовали.
Концентрации антигена брали 2,5, 5, 10 мкг/мл. Да, со всеми сыворотками, даже с контрольными здоровыми.

guest: ммм
IP-штамп: frQlBxj4iQSg.
гость

06.04.2013 18:14

URL #16

У меня почему-то ощущение, что возможен еще вариант, когда антитела из сыворотки садятся на пластик, несмотря на забивку и тд. как и почему это происходит я не знаю. Может пластик какой-то странный, может буфер забивки какой-то неправильный, может концентрация забивки не достаточная.

hydrohinon7

06.04.2013 18:21

URL #17

У меня какое-то такое же ощущение, причем c плашками средней сорбции происходит то же самое, что и высокой сорбции, а буфер забивки - стандартный однократный PBS без твина, вроде как положено. В общем, в любом случае большое спасибо, попробуем еще. мысли вроде у всех текут в одном направлении.

Daemonarchestratygos
Постоянный участник

10.06.2013 15:08

URL #18

(hydrohinon7 @ 06.04.2013 16:21)

мысли вроде у всех текут в одном направлении.

Это настораживает.

watchesbiz
Постоянный участник

06.12.2021 17:12

URL #19

http://www.authorstream.com/Replicawatches24/
https://about.me/Replicawatches24
https://moz.com/community/users/17050093
https://trello.com/rolexrelicawatches/activity
https://replicarolexwatches.dreamwidth.org/365.html
https://visual.ly/users/watcheshutuk/portfolio
https://www.viki.com/users/watcheshutuk_549/about
https://www.academia.edu/s/14bdb7d4fe?source=link
https://www.slideshare.net/Nowseore/guide-o...ex-watch-online
https://audiomack.com/rolexrelicawatches
https://soundcloud.com/replicarolexwatches
https://www.bagtheweb.com/u/fakerolexwatches/profile
https://www.flipsnack.com/ReplicawatchesUK/...ca-watches.html
https://www.4shared.com/office/zA4L7Rmzea/G...hase_a_Fak.html?
https://codepen.io/Rolexrelicawatches/full/abBEzaQ

Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.

Имя:

Отправка сообщений использует JavaScript операции. В вашем броузере не
установлено/отключено выполнение JavaScript программ. Используйте Netscape Navigator
или Internet Explorer (не ранее 3 версии); убедитесь, что выполнение JavaScript
программ разрешено в настройках вашего броузера.