Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Aleksis17 |
две разные реакции, обе на Су5. 1. 95-3' (95-15'', 61-1')x40 2. 95-3' (95-15'', 58-45'')x40 по цифрам все нормально, но почему такой низкий RFU? с другими красками проблем нет Картинки: 1.jpg — (154.19к) 14.06.2017 — 14.12.2017 2.jpg — (151.86к) 14.06.2017 — 14.12.2017 |
Carbon Copy Постоянный участник So close no matter how far |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
Синтезируйте зонд в другой фирме. На самом деле на CFX Cу5 светит в своем канале в несколько раз сильнее чем тот же FAM в эквимолярных количествах. |
Horse-radish Участник |
|
13ZC |
|
Carbon Copy Постоянный участник So close no matter how far |
(-Ъ- @ 14.06.2017 14:33) Похоже на то, что ошиблись концентрацией зонда в 5-10 раз. Синтезируйте зонд в другой фирме. На самом деле на CFX Cу5 светит в своем канале в несколько раз сильнее чем тот же FAM в эквимолярных количествах. Наврядли они ошиблись с концентрациями проб в двух разных экспериментах. Однако, если обе пробы заказаны от одного производителя, тогда обе могут быть кривыми. Интересно, когда в России станут называть TaqMan probes пробами (как в всём остальном мире), а не зондами? |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(Carbon Copy @ 14.06.2017 18:42) Наврядли они ошиблись с концентрациями проб в двух разных экспериментах. Однако, если обе пробы заказаны от одного производителя, тогда обе могут быть кривыми. Интересно, когда в России станут называть TaqMan probes пробами (как в всём остальном мире), а не зондами? А немцы на своем родном знаете как их называют? Так что уже поздно, немцы опередили англичан. |
Aleksis17 |
Все таки грешу на качество проб. Заказаны были у одного производителя, но в разное время. |
avial Постоянный участник |
|
kblag Постоянный участник |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
Стрелочник ошибся! при разбавлении. Последовательности ЗОНДА (для Карбоныча) и праймеов в студию! Может быть зонд у Вас сопливый (короткий, зашпиленный), а может быть даже дело в горбатых праймерах. Но по виду кривых (накоплению сигнала) зонд работает прилично, но мало светит. |
kblag Постоянный участник |
может быть даже дело в горбатых праймерах раститровка, по крайней мере, нормальная есть фраза с другими красками проблем нет , но не понятно, это одинаковые зонды на разных красках или разные зонды. Думаю, тут это ключевой момент.
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(kblag @ 22.06.2017 16:47) раститровка, по крайней мере, нормальная есть фраза , но не понятно, это одинаковые зонды на разных красках или разные зонды. Думаю, тут это ключевой момент. Ошибиться при приготовлении серии разбавлении - это надо постараться. Я имел ввиду то, что зонд изначально был разбавлен, т.е. написано 10 мкМ, а там реально 1. А зачем один и тот же зонд метить разными красками? Не знаю, видимо большой наукой занимается чел.
|
kblag Постоянный участник |
Ошибиться при приготовлении серии разбавлении - это надо постараться. no.gif это я к тому, что если праймеры совсем кривые то эффективность реакции по раститровке ДНК будет низкой А зачем один и тот же зонд метить разными красками? могли изначально сделать FAM, потом решили засунуть в мультиплекс и перекинули на Cy5 Вообще изначально выбор Cy5 не совсем стандартен, если это не мультиплекс |
Aleksis17 |
отвечаю сразу на все вопросы. первый эксперимент TMTRI,f CAGCAGMTRCTCAAGGTAGACCC; TMTRI,r AACTGTAYACRACCATGCCAAC; TMTri,p Cy5-AGCTTGGTGTTGGGATCTGTCCTTACCG -BHQ2 95° for 3 min; [95° for 15 s; 60° for 60 s]×40. взято отсюда: Yli-Mattila T, Paavanen-Huhtala S, Jestoi M, Parikka P, Hietaniemi V, Gagkaeva T, Sarlin T, Haikara A, Laaksonen S, Rizzo A (2008) Real-time PCR detection and quantification of Fusarium poae, F. graminearum, F. sporotrichioides and F. langsethiae in cereal grains in Finland and Russia. Arc Phytopathol Plant Protect 41(4):243–260. doi: 10.1080/03235400600680659 коллеги говорят, что эта реакция всегда хорошо работала, но это было до моего прибытия в количественный анализ второй эксперимент fum1_fw ATGCAAGAGGCGAGGCAA; fum1_rev GGCTCTCAGAGCTTGGCAT; fum1_probe CY5-CAATGCCATCTTCTTGAAACCT-BHQ2. 95° for 15 min; [95° for 15 s; 58° for 45 s]×40. отсюда Preiser et al Development of a multiplex real-time PCR to quantify Fusarium DNA of trichothecene and fumonisin producing strains in maize // Anal. Methods, 2015 DOI: 10.1039/C4AY02581D все праймеры и пробы заказаны в питерском Beagle, но в разное время, стоки разводились согласно паспортам. ошибка в разведении стока на порядок была бы видна невооруженным глазом. рабочие растворы постоянно обновляются - результат тот же. |
kblag Постоянный участник |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
Тогда остается грешить на плохой синтез или развал зонда при хранении - 70-80% зонда потеряли метку или часть зонда вышел без метки при синтезе, если такое возможно. Звоните непосредственным исполнителям, синтезируйте на другой фирме. Повторюсь, Су5 наоборот светится в несколько раз сильнее чем другие краски. А может у меня чудомастермиксы. |
Aleksis17 |
(kblag @ 28.06.2017 14:59) для мультиплекса |
Horse-radish Участник |
(-Ъ- @ 29.06.2017 12:48) Прям уж в разы сильнее? На каком циклере ставите? |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(Horse-radish @ 29.06.2017 16:22) Да, в разы. Экономлю Cy5, ROX и VIC выравнивая с FAM в мультиплексе. На CFX96, как раз по теме. Но эта тенденция наблюдается на всех приборах, даже на флуориметрах (Gene, Tecan).
|
kblag Постоянный участник |
Да, в разы. Экономлю Cy5, ROX и VIC выравнивая с FAM в мультиплексе. Подтверждаю, Cy5 светит отлично. Я бы пересинтезировал. Ещё можно посмотреть кривые без вычитания фона. При плохом синтезе может быть фон начальный высокий. Сообщение было отредактировано kblag - 29.06.2017 19:27 |
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |