Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
|
Автор - <Lake>: Уважаемые коллеги! Помогите советом У меня не идет ПЦР фрагмента 640 п.о. из сухих пятен крови. При этом: 1)ПЦР этого же фрагмента из ДНК, выделенной из лейкоцитов или мышц (печени, и т.д.) идет нормально. 2)ПЦР меньших фрагментов из пятен идет хорошо. Пятна обрабатываются метанолом, либо инкубируются в воде. Возможно, кто-то делал ПЦР длинных фрагментов из сухих пятен Заранее спасибо </blockquote> В крови много железа в порфирине, оно может ПЦР ингибировать. Правда, пункт 2 это не объясняет. Тем не менее, попробуй выделять ДНК со смолой Chelex-100, помогает. Метод специально для выделения ДНК из сухих пятен крови, используется в криминалистике. Работает очень быстро, достаточно прикипятить образец в воде со смолой и отобрать супернатант. Сама смола используется для очистки воды от примесей, найти ее у химиков не сложно. Удачи! |
|
|
|
Walsh P, Metsger D, Higuchi R. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. Biotechniques 1991;10:506 –13. Вот протокол: Chelex Protocol 1) Place 200 µl of 5% (w/v) Chelex® 100 (BioRad) into either a Perkin Elmer 0.2ml thin walled PCR tubes or a Corning-Costar polypropylene 96-well PCR tray and place on ice. Remember to stir chelex with magnetic stir bar and use wide bore pipette tips to aspirate and dispense chelex solution. 2) Place an extremely small piece of tissue (0.3mm2) into each tube and centrifuge (~1000 rpm for 1 min.) to settle tissue and chelex. 3) Cover tubes with strip caps (Perkin Elmer) or silicone sealing mats (Corning-Costar) and incubate at 60o C for 20 minutes. 4) Place in thermal cycler at 103o C for 25 minutes and then soak at 10o C. 5) Spin (2000 rpm for 3 min.) to settle tissue and Chelex® 100 beads. Remove 100 ul supernatant and place in new reservoir tray. This reservoir tray holds the DNA template. Store the reservoir tray at 4o C until finished with the samples and then store at -20o C. The remaining chelex/tissue solution can be freezed down as a back up stock. 6) Determine empirically the volume of DNA template to be used for PCR (typically 1 or 2 µl, however the actually quantity of DNA will be unknown). А вот ссылка по которой все это можно найти: www.google.com ;-))) |
Redactor admin. Берлин, Германия |
Ко всем участникам форума: я весь форум не читаю, если будет что полезное, не сочтите за труд послать ссылку: redactor@molbiol.ru . |
foma St.Petersburg, Nepal - Pokhara |
|
|
Автор - foma: А кто-нибудь реально использовал Chelex-100 для работы? Действительно исключает ингибиторы и как эфективно? </blockquote> Ну дык! Я же и использовал, работает. |
foma St.Petersburg, Nepal - Pokhara |
|
foma St.Petersburg, Nepal - Pokhara |
|
|
Автор - foma: тогда каринку присылай быстрее, пожалуйста. </blockquote> Ну вы даете! Это ж года 3-4 назад было, в России еще. Но метод работает, зуб даю ;-))) |
foma St.Petersburg, Nepal - Pokhara |
|
|
|
carbide insert quotation IP-штамп: frxgiSAsc0sVA гость |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |