Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Yuly |
У меня следующая проблема. Проводим вестернблот лизата крысиной мышцы. И никак не можем избавится от неспецифического связывания вторичных антител goat-anti-mouse на НЦ-мембране. Пример, как получается на пленке после обработки мембраны ECL, можно увидеть в прикрепленном файле. полоса 1 - тотАМРК+ молоко 4%. полоса 2 - негативный контроль к полосе 1, т.е. без первичных антител к тотAMPK, вместо них TBST c 4% молоком, а потом вторичка GAM полоса 3 - тотАМРК + BlockPro (какой-то коммерческий реагент для блокировки). полоса 4 - негативный контроль к полосе 2, опять же без первичных антител, вместо них TBST c BlockPro. Буду очень благодарна за советы! |
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
|
Guest IP-штамп: fr7i52aYQi8Kk гость |
|
LMP Постоянный участник |
|
Yuly |
(guest: ммм @ 11.08.2014 15:35) Так разводите GAMы пока не уйдет неспецифика. Если при этом они все еще будут видеть мышинные антитела, то жизнь прекрасна. Кстати, не могли бы вы сообщить мол вес жирных полос. А также фирму и каталожный номер вторичных коньюгатов. Здесь разведение вторичных антител 1:200 000, делали и 1:300 000, история похожая. Жирные в районе 80-90 кДа. Здесь вторичка SantaCruz sc-2005, но пробовали GAM и Bio-Rad, такая же история, разводили до 1:400 000, не было грязи, но похоже и первичные тогда "не видит". |
Yuly |
(Guest @ 11.08.2014 15:59) В помойку всё. Новые антитела/antibodies, новый лизат и, к сожалению, новую белую умную красивую крысу нужно на опыты уничтожить. Так что думать и проверять антитела и реактивы нужно было заранее. Пробовали и другие, GAM Bio-Rad, такая же история и лизат переделывали. Это как раз и есть проверка. На крысином материале GAM ведут себя одинаково. Думала, может есть какие-то хитрости, о кот. еще пока не в курсе. |
Yuly |
(LMP @ 11.08.2014 17:00) Делали, но все равно лезут полосы, а нужного белка не видно. Я так понимаю, что нужно разводить антитела дальше, но боюсь, тогда и первичные вторичка "не видит"... |
Guest IP-штамп: fr7i52aYQi8Kk гость |
|
guest: ммм IP-штамп: fre/rrUGoIiqA гость |
|
Guest IP-штамп: fr7i52aYQi8Kk гость |
|
Yuly |
(Guest @ 11.08.2014 18:12) Хитростей нет, всё примитивно и просто. Плохой лизат с испортившимся белком или отсутствием нужного белка-плохие первичные антитела- плохие вторичные антитела-неверное следование элементарному протоколу. Книжку почитайте по иммунологии, практикум, там всё написано. Раньше получали нормальные результаты с этими антителами-лизатом и пр.? По пунктам проверяйте, в интернете нельзя сказать, что неверно. С этим лизатом и первичными антителами, только rabbit получали отличные результаты, берем первичные mouse и получается такая вот картинка. Спасибо, найду практикум по иммуноголии и почитаю. |
Yuly |
(Guest @ 11.08.2014 18:38) Или соль понизить или воды добавить... Ну и так далее советы далее будут. Материал без надобности не портить, думать вначале нужно. (guest: ммм @ 11.08.2014 18:18) Тогда это перегруз на блоте скорее всего. Ну и можно соль повысить при инкубации, и все таки какой мол. вес неспецифичных зон Спасибо. Попробую изменить соль, мол.вес 80-90 кДа. |
guest: ммм IP-штамп: frQlBxj4iQSg. гость |
|
Yuly |
(guest: ммм @ 12.08.2014 11:27) В принципе, да |
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
И наверное известно, что это за мажорный белок в экстракте. Посмотреть почему ему так ловко удается выдавать себя за антитела мыши. |
Yuly |
(guest: ммм @ 12.08.2014 14:04) Ну тут еще совет уменьшать общую белковую нагрузку на форез, что конечно будет приводить к снижению чувствительности. Так же можно попробовать коньюгат против Fab -фрагмента. И наверное известно, что это за мажорный белок в экстракте. Посмотреть почему ему так ловко удается выдавать себя за антитела мыши. Хм, спасибо большое! |
Guest IP-штамп: fr7i52aYQi8Kk гость |
|
Yuly |
(Guest @ 12.08.2014 15:26) Производят первичные антитела только mouse (не к AMPK, кот. в примере, а к другому белку), других нет. И большинство моноклонов mouse, поэтому как-то хочется эту проблему решить. |
ship Постоянный участник Moscow |
может просто стоит купить хорошие антитела? равно , как и хорошие вторичные. ну и уж явно не от санта-круз. селл сигналинг в россию возит Акрус, и цены у них приемлимые и сроки нормальные обещают. |
Guest IP-штамп: fr7i52aYQi8Kk гость |
|
guest: ммм IP-штамп: fre/rrUGoIiqA гость |
1)авирр утверждает, что другие антитела были опробованны с аналогичным результатом. 2)Совершенно непонятно как определить, хорошесть антител на расстоянии по сайту, или даже держа в руках пробирку с этикеткой. |
Yuly |
(ship @ 12.08.2014 21:37) может просто стоит купить хорошие антитела? равно , как и хорошие вторичные. ну и уж явно не от санта-круз. селл сигналинг в россию возит Акрус, и цены у них приемлимые и сроки нормальные обещают. Первичные мы берем всегда cell signaling или abcam. Но есть антитела, кот. нам нужны, их производят только mouse. Я писала об этом выше. Картинку AMPK мышиный я привела просто, показать, что дают вторичные GAM на крысином лизате. Такую картинку показывает не только santa cruz, но и GAM от Bio-Rad. |
Yuly |
|
Yuly |
(Guest @ 12.08.2014 22:43) То есть хорошая картинка, показывать не нужно картинку, с поликлональными кролика и всем остальным, но моноклональные мышиные не работают, верно? Еще авангардный вариант самим сделать моноклональные мышиные, но тут уже снова недостаток информации начальной и возможности нужно знать. Думаю, что не совсем поняла Ваш вопрос, но в качестве первичных антител я не сомневаюсь. |
ship Постоянный участник Moscow |
то бишь есть мышиные антитела к АМРК, и именно они вам нужны? эти антитела откуда? кто производитель? они вообще как работают? одну полосу красят или забор? говорите, что в их качестве не сомневаетесь? судя по картинкам - я бы засомневался. Могу точно сказать, если первичные антитела ничего не красят на мембране, то такой забор, который вы видите на картинках, ни одни хорошие вторичные антитела не дадут. ну и как сказали выше, у вас либо перегруз либо пересвет мембраны, либо и то и другое. кстати, антитела у вас часом не к какому нибудь фосфо-сайту? если так, то инкубировать надо в БСА, а не в молоке. опять таки, время инкубации с антителами тоже не указали. да и протокол вестерна не привели. может вы где то еще ошибаетесь |
Guest IP-штамп: fr0GcpbomUbps гость |
|
Guest IP-штамп: fr0GcpbomUbps гость |
|
Guest IP-штамп: fr7i52aYQi8Kk гость |
После попробовали абсолютно всё то же самое, но заменили поликлональные первичные антитела на моноклональные мышиные. Получили полностью неспецифичное окрашивание, верно? Следовательно проблема в новых антителах, которыми стали моноклональные мышиные антитела, верно? Так и не получен ответ на ворпос, зачем нужно снова красить моноклональными мышиными антителами, когда уже получено доказательство с помощью поликлональных кроличьих антител. Все верно? |
Guest IP-штамп: frGqyYT8IU7LU гость |
|
Yuly |
(Guest @ 13.08.2014 13:55) купим планшетный спектрофотометр и будем делать ифа |
Yuly |
(ship @ 13.08.2014 12:40) как писал гость, из ваших постов все таки не совсем все понятно. то бишь есть мышиные антитела к АМРК, и именно они вам нужны? эти антитела откуда? кто производитель? они вообще как работают? одну полосу красят или забор? говорите, что в их качестве не сомневаетесь? судя по картинкам - я бы засомневался. Могу точно сказать, если первичные антитела ничего не красят на мембране, то такой забор, который вы видите на картинках, ни одни хорошие вторичные антитела не дадут. ну и как сказали выше, у вас либо перегруз либо пересвет мембраны, либо и то и другое. кстати, антитела у вас часом не к какому нибудь фосфо-сайту? если так, то инкубировать надо в БСА, а не в молоке. опять таки, время инкубации с антителами тоже не указали. да и протокол вестерна не привели. может вы где то еще ошибаетесь AMPK не нужны, я писала выше. Мы используем всегда Cell sign или abcam. Тут AMPK Cell sign. И красят одну полосу. И не только на них проверяли, на многих мышиных от cell sign или abcam, дело во вторичных, кот. как ни разбавляй все равно устойчиво дают полосу на 80-90 кДа. При меньшей выдержке и при загрузе 10 мкг, не так явно, но все же фон от вторичных есть (вторичку пробовали и santa cruz и bio-rad, к Fc) |
Yuly |
(Guest @ 13.08.2014 15:34) Абсолютно нет логики. Вы, автор темы, сообщили, что ранее применяли в качестве первичных поликлональные антитела из кролика и получили всё замечательно, верно? После попробовали абсолютно всё то же самое, но заменили поликлональные первичные антитела на моноклональные мышиные. Получили полностью неспецифичное окрашивание, верно? Следовательно проблема в новых антителах, которыми стали моноклональные мышиные антитела, верно? Так и не получен ответ на ворпос, зачем нужно снова красить моноклональными мышиными антителами, когда уже получено доказательство с помощью поликлональных кроличьих антител. Все верно? 1. Верно. 2. Верно. 3. Нет, так сказать нельзя т.к. меняется вторичка. 4. Нет, те антитела, кот. нам нужны выпускают только мышиные и это не AMPK. Нужно решить проблему со вторичными мышиными антителами т.к. только при сильном разведении, при соблюдении всех забивок и длительности отмывок, такие пятна пропадают, но при этом, какую бы высокую концентрацию первичных не давали, полоса с ними не проявляется. Проверяли не только на AMPK, но и на других первичных от cell sign и abcam. Не думаю,что нам так "везет" и все мышиные, кот. нам поставляют такие плохие. |
Guest IP-штамп: fr7i52aYQi8Kk гость |
|
ship Постоянный участник Moscow |
|
Guest IP-штамп: fr7i52aYQi8Kk гость |
|
Yuly |
(ship @ 15.08.2014 21:43) а сразу слабо было написать, что проблема во вторичных???? то что используете -в помойку, и купите вторичные от GE Healthcare. и будем Вам счастье. Я это писала и не раз! |
Azato2000 Постоянный участник |
(Yuly @ 14.08.2014 12:39) не ищите легких путей? ИФА ридер сейчас имеется в любой захудалой коммерческой клинической лаборатории. Неужели нет знакомого биолога, подрабатывающего в такой лабе? |
Guest IP-штамп: fr.vwiRMFbky2 гость |
|
asd IP-штамп: fr.vwiRMFbky2 гость |
|
guest: 123 IP-штамп: frJhOCvSv9ICE гость |
|
asd IP-штамп: fr.vwiRMFbky2 гость |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |