Так разводите GAMы пока не уйдет неспецифика. Если при этом они все еще будут видеть мышинные антитела, то жизнь прекрасна. Кстати, не могли бы вы сообщить мол вес жирных полос. А также фирму и каталожный номер вторичных коньюгатов.

  В помойку всё. Новые антитела/antibodies, новый лизат и, к сожалению, новую белую умную красивую крысу нужно на опыты уничтожить. Так что думать и проверять антитела и реактивы нужно было заранее.

  Если фото с пленки, то это "передержано". Экспонировать 15-20 сек.

  Хитростей нет, всё примитивно и просто. Плохой лизат с испортившимся белком или отсутствием нужного белка-плохие первичные антитела- плохие вторичные антитела-неверное следование элементарному протоколу. Книжку почитайте по иммунологии, практикум, там всё написано. Раньше получали нормальные результаты с этими антителами-лизатом и пр.? По пунктам проверяйте, в интернете нельзя сказать, что неверно.

  Или соль понизить или воды добавить... Ну и так далее советы далее будут. Материал без надобности не портить, думать вначале нужно.

  Тогда это перегруз на блоте скорее всего. Ну и можно соль повысить при инкубации, и все таки какой мол. вес неспецифичных зон

  Да соль похоже мало поможет. А на кумаси(серебре, понсе) эти зоны как мажоры?

  Ну тут еще совет уменьшать общую белковую нагрузку на форез, что конечно будет приводить к снижению чувствительности. Так же можно попробовать коньюгат против Fab -фрагмента.

  И наверное известно, что это за мажорный белок в экстракте. Посмотреть почему ему так ловко удается выдавать себя за антитела мыши.

  Зачем mouse взяли?

  http://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/5831
может просто стоит купить хорошие антитела?
равно , как и хорошие вторичные. ну и уж явно не от санта-круз.

селл сигналинг в россию возит Акрус, и цены у них приемлимые и сроки нормальные обещают.

  То есть хорошая картинка, показывать не нужно картинку, с поликлональными кролика и всем остальным, но моноклональные мышиные не работают, верно? Еще авангардный вариант самим сделать моноклональные мышиные, но тут уже снова недостаток информации начальной и возможности нужно знать.

  А стоит ли мучиться с иммуноблотом, когда есть коммерческий набор ИФА?

  как писал гость, из ваших постов все таки не совсем все понятно.
то бишь есть мышиные антитела к АМРК, и именно они вам нужны? эти антитела откуда? кто производитель? они вообще как работают? одну полосу красят или забор?
говорите, что в их качестве не сомневаетесь? судя по картинкам - я бы засомневался.
Могу точно сказать, если первичные антитела ничего не красят на мембране, то такой забор, который вы видите на картинках, ни одни хорошие вторичные антитела не дадут.

ну и как сказали выше, у вас либо перегруз либо пересвет мембраны, либо и то и другое.
кстати, антитела у вас часом не к какому нибудь фосфо-сайту?  если так, то инкубировать надо в БСА, а не в молоке.  опять таки, время инкубации с антителами тоже не указали. да и протокол вестерна не привели. может вы где то еще ошибаетесь

  Абсолютно нет логики. Вы, автор темы, сообщили, что ранее применяли в качестве первичных поликлональные антитела из кролика и получили всё замечательно, верно?

После попробовали абсолютно всё то же самое, но заменили поликлональные первичные антитела на моноклональные мышиные. Получили полностью неспецифичное окрашивание, верно?

Следовательно проблема в новых антителах, которыми стали моноклональные мышиные антитела, верно?

Так и не получен ответ на ворпос, зачем нужно снова красить моноклональными мышиными антителами, когда уже получено доказательство с помощью поликлональных кроличьих антител. Все верно?

  а сразу слабо было написать, что проблема во вторичных???? то что используете -в помойку, и купите вторичные от GE Healthcare. и будем Вам счастье.

  купим планшетный спектрофотометр и будем делать ифа