Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Проблема с клонированием -- Почему не растут клетки с плазмидой? --
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! Heather




 прочитанное сообщение 06.08.2018 15:01     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Народ! Нужен совет профессионалов.
Проблема такая.
Нужно заклонировать белок Х в YFP и BFP векторы. В нашей группе он уже был заклонирован в GFP вектор. Это было сделано другими людьми, в лабораторном журнале подробностей не описано (как и проблем), но концентрация ДНК очень низкая, по сравнению с нашими обычными минипрепами. Стали делать новые клонирования и застряли. Делаем лидирование. Колонии есть, но требуют 2-3 дня, что бы хоть чуть-чуть вырасти. На этом останавливаются и дальше доращивать их уже бесполезно. Пытаемся из этих колоний вырастить минипрепы. Культура растет где-то до оптической плотности 0.05-0.1 и встает. Как бы похоже на токсичность. Стали выращивать их на более низких оборотах (140-150) и при 25оС. Ситуация немного улучшилась, но все равно не достаточно. В таких условия дорастает до плотности 0.1-0.2. Вырастили 100 миллилитров, скрутили, сделали минипрепы. Концентрация ДНК отличная, где-то 200нг/мкл. При этом сиквенсы пришли нечитабельные. Нанесли эту ДНК на гель - пусто.
Кто-нибудь с таким сталкивался? Что с этим делать и как через это прорваться?
Заранее спасибо за помощь и совет.
ПС. Пробовали несколько разных типов компетентных клеток, даже экспрессивные попробовали.
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 06.08.2018 16:08     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

--Колонии есть, но требуют 2-3 дня
Не! Это значит что их нет!
И значит: либо не идет рестрикция (плохие концы), либо не идет лигирование, либо не идет трансформация.

Трансформацию проверить на pUC, Рестрикцию и лигирование на фаге лямбда. После этого можно снова ставить клонирование. Если все работает, то рано или поздно получите клон может не с первого раза, а с 20ого. Если не работает менять реактивы на работающие пока не заработают, потом клонировать.
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 06.08.2018 16:52     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

Напишете подробно что и как клонируете и как все делаете. какие сайты, как режете, ПЦР-продукт или просто кДНК по рестрикции надо перекинуть из одно вектора в другой и тп.
Участник оффлайн! R-J-Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 08.08.2018 17:28     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

"Концентрация ДНК отличная, где-то 200нг/мкл. При этом сиквенсы пришли нечитабельные. Нанесли эту ДНК на гель - пусто"
как это, что Вы измеряли? Нано, -прости господи, дропом, что ли? То есть перед сиквенсом на форез плазмиду не наносили? Круть!

Короче, надо бы еще проверить антибиотиковую устойчивость Ваших исходных плазмид. Поставьте тупо перетрансформацию. Посмотрите, что где растет (ампициллин, канамицин, других вариантов нет- если это плазмида для маммалиан экспрессии, то скорее всего известная серия векторов в флуор. генами, канамицин)
Если бактериальная- то ваще все просто, колонии светиться (и быть окрашенными) должны
Участник оффлайн! watchesbiz
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  20.11.2021 17:42     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

https://jumpshare.com/v/QxZ9Rn2mfDCaBq2AdBG1
https://www.edocr.com/v/znnrba3z/watcheshut...lica-Watches-UK
https://www.tuugo.us/Companies/best-replica...s/0310006695505
https://topsitenet.com/article/988178-hints...ca-rolex-watch/
http://simp.ly/p/nxGlWb
https://telegra.ph/Hints-on-Choice-of-a-Hig...lex-Watch-02-22
https://replicarolexwatche2.blog.fc2.com/blog-entry-1.html
https://www.knowpia.com/s/blog_60f7e7c31014a97a
https://zenwriting.net/replicawatches24/hin...ica-rolex-watch
https://globalcatalog.com/replicawatchesuk.us/en
http://www.cplusplus.com/articles/iE1wvCM9/
https://eatsleepride.com/c/346210/hints_on_...ica_rolex_watch
https://www.myminifactory.com/users/watcheshutukcom
https://www.mioola.com/ReplicawatchesUK/post/199764/
https://en.gravatar.com/allreplicawatches24
https://8tracks.com/replicawatchesuk
Участник оффлайн! watchesonline89
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  26.12.2022 10:52     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

https://omegawatches89.simplesite.com/452939033
https://dailygram.com/index.php/blog/116219...eplica-watches/
https://plaza.rakuten.co.jp/omegawatches89/...y/202208040000/
https://blog.easyfie.com/how-to-prepare-you...on/#comment-285
https://form.jotform.com/223253786289064
https://discussions.ubisoft.com/user/omegawatches89
https://www.worldranklist.com/profile/108194
https://blog.udn.com/omegawatches89/176226568
https://penzu.com/p/56f52c40
https://62e8ce2ae5d50.site123.me/blog/tips-...replica-watches
https://omegawatches91.mystrikingly.com/
https://ameblo.jp/omegawatches89/entry-12756647425.html
https://telegra.ph/Where-To-Find-Elegant-An...es-Online-08-03
https://omegawatches89.seesaa.net/article/490300768.html
https://medium.com/@omegawatches89/reasons-...ar-e16d1fabc26f
https://omegawatches89.simplesite.com/452939109
https://teletype.in/@omegawatches89/bVw2sShID4x
https://www.pearltrees.com/omegawatches89#item456651209
https://dailygram.com/index.php/blog/116219...eplica-watches/

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 28.03.24 17:47
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft