Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Методы -- comments to a permanent page of the site --
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Тема связана с: Методы
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Гость
IP-штамп: frXBaTONIry9A
гость



 прочитанное сообщение 27.02.2009 12:33     Сообщение для модератора       

Доброго времени суток! Был бы очень благодарен, если бы кто-нибудь поделился методикой приготовления конъюгатов моноклональных антител с фикоэритрином. Заранее спасибо!
Гость
IP-штамп: frltbIKmJu36Q
гость



 прочитанное сообщение 27.02.2009 14:03     Сообщение для модератора       

Уважаемые коллеги, помогите определиться по следующим вопросам: задача такая - выделение белка из крови( белок низкомолекулярный с мембраной не связанный, индуцибельный т.е. в клетках его мало - репаративный фермент АГТ) из культуры клеток его мы выделяем и протокол имеется - по отработанной методике для детекции на вестерне клеток для выделения белка нужно не менее 10 млн а можно и больше
вопросы у маня такие
- сколько примерно мл крови нужно взять что бы выделить этот белок? достаточно ли 10 мл?
- гепаринизация крови - подскажите или "ткните носом" в протокол сколько гепарина на мл крови
- и осаждение феколом - тут вообще у меня опыта нет - сколько фекола, какие условия - если подкините методику или ссылкку на таковую буду крайне признательна
Заранее спасибо за советы , подсказки и Ваши соображения
Гость
IP-штамп: frDQwa9k7riYg
гость



 прочитанное сообщение 16.03.2009 08:12     Сообщение для модератора       

Гостю, который спрашивал про гепарин.
Мы добавляли 40 мкл аптечного на 10 мл крови, а вообще есть вакутайнеры с гепарином - с зеленой крышечкой. Фиколл готовится из двух компонентов - собственно фиколла и урографина или верографина, плотность полученного растворчика д.б.1.077. Наливаете в пробирку фиколл (3 мл), а сверху НАСЛАИВАЕТЕ (чтоб не смешалось) 5-6 мл крови (иногда кровь разводят средой, но по мне так это дело вкуса) и на центрифужку - 1500 оборотов, 20 -30 минут (лучше попробовать сначала меньшее время, чтобы все нужное не попадало). Достаете из центрифуги и видите - над столбиком осевших эритроцитов и гранулоцитов желтоватый слой фиколла, потом белое кольцо клеток и слой плазмы. Осторожно собираете белый слой -это и есть клетки. Отмойте их обязательно не меньше 2 раз, поскольку фиколл токсичен. Удачи!!
Участник оффлайн! Privalov

Москва, Санкт-Петербург



 прочитанное сообщение 22.03.2009 22:53     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

Доброго времени суток! Уважаемые коллеги, помогите, пожалуйста решить следующую задачу - растворить нитросиний тетразолий (методика изучения ферментативной активности гранулоцитов). Растворяю в ПБС, на 1 мг НСТ беру 1 мл ПБС. Растворяется плохо, даже если нагреть раствор до 60-70 градусов (по методике). Что же делать? Может быть, истек срок годности вещества?
guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость



 прочитанное сообщение 24.03.2009 19:20     Сообщение для модератора       

--Растворяю в ПБС, на 1 мг НСТ беру 1 мл ПБС. Растворяется плохо, даже если нагреть раствор до 60-70 градусов (по методике). Что же делать? Может быть, истек срок годности вещества?

Попробуйте сначала растворить соль в 70% ДМФА, а потом уже в ПБС
Гость
IP-штамп: frsqCqXJdPw/M
гость



 прочитанное сообщение 01.04.2009 07:36     Сообщение для модератора       

методы получения моноклональных антитель для животных
Гость
IP-штамп: frsqCqXJdPw/M
гость



 прочитанное сообщение 01.04.2009 07:36     Сообщение для модератора       

методы получения моноклональных антител для животных
Участник оффлайн! Umo4ka




 прочитанное сообщение 02.04.2009 10:21     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

Уважаемые коллеги, подскажите,пожалуйста,как оптимально снять с поверхности зубной эмали биопленку,чтобы оценить потом белковый состав. ТО есть сняться должно по возможности все, что "село" во рту, и полученный раствор должен быть пригоден для фореза. Проблема в том, что площадь исследуемой поверхности - мах.1кв.см,да еще и общий белок надо бы знать до фореза.Вот ивыходит - с гулькин чих на все-про все. Как бы изловчиться? Ищем лизоцим, лактоферрин, муцин, амилазу иеще много чего.
Спасибо!
guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость



 прочитанное сообщение 02.04.2009 11:13     Сообщение для модератора       

Эк вас занесло. Для начало определитесь что есть биопленка, где кончается пленка и начинается эмаль. А потом можно поразмышлять. А так дайте больному рат пополоскать рот содой питьевой, да в этом растворе потом щеткой зубной зубы почистить да все сплюнуть и анализируйте до посинения.
Участник оффлайн! Umo4ka




 прочитанное сообщение 02.04.2009 12:03     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

Определяюсь. Биопленка-это свободный от бактерий слой из белков, гликопротеинов, углеводов и липидов, формирующийся непосредственно на поверхрности эмали в норме ивыполняющий роль смазки, защиты от эрозии, депо ионов и реминерализации. Сверху биопленки формируется бляшка- ну уже зловредная, с бактериями и пр.Но сейчас меня интересуют первые 3 минуты формирования биопленки, поэтому слой будет базальный. Больных, слав Богу нет, зубычистить некому, а кусочек зуба 5х5х1 мм на соответствующем носителе будет помещен зашеку на 3 мин. Вот с этим кусочком мне потом и играться....
А механически не хочетсяиз-зипотерь. Ну разве что резиновым шпателем, как при сборе клеток. Так там сначала трипсин... Попробовать и мне трипсином что-ли?
А если сплюнуть, кстати, то анализировать действительно можнодо посинения. Идеякакраз в том,что в разныхртахразное "садится" на зуб,хотя в слюне всепримерно одинаково. Так что "сплюн" меня как раз не интересует! Вернее интересует, но отдельно от пленки. wink.gif
guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость



 прочитанное сообщение 02.04.2009 14:11     Сообщение для модератора       

-это свободный от бактерий слой
Не выполнимое требование.
--Больных, слав Богу нет, зубычистить некому, а кусочек зуба 5х5х1 мм на соответствующем носителе будет помещен зашеку на 3 мин. Вот с этим кусочком мне потом и играться....

Гы-гу га.

Ну покипятите "Зуб" в 1%SDS может это вам поможет.
Участник оффлайн! Umo4ka




 прочитанное сообщение 06.04.2009 16:36     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

Спасибо!
Участник оффлайн! vvv2509
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 26.10.2009 13:40     Сообщение для модератора         Личное письмо

Уважаемые коллеги, подскажите как синтезировать siRNA, может кто-то работал в этом направлении или у кого-то есть протоколы. Буду очень признательна!
Участник оффлайн! Privalov

Москва, Санкт-Петербург



 прочитанное сообщение 20.01.2010 00:45     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

Уважаемые коллеги, буду крайне признателен, если кто-нибудь отзовется!!
Кто-нибудь работал над определением количества клеток, продуцирующих цитокины с помощью проточно
Вся загвоздка в брефелдине-моненсине, добавляемого для блокировки транспорта цитокинов через мембрану.
Вопрос - как разводить вещества (куплены в Сигме, сухие, инструкции НЕ прилагаются)???
Участник оффлайн! Privalov

Москва, Санкт-Петербург



 прочитанное сообщение 20.01.2010 00:49     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

Уважаемые коллеги!
Буду крайне признателен, если отзоветесь!!!
Кто-нибудь работал с определением клеток, продуцирующих цитокины на проточном цитометре?
Вся загвоздка в брефелдине-моненсине, блокирующих транспорт цитокинов через мембрану. Есть сухие, куплены в Сигме, инструкции НЕ прилагаются.
Вопрос - КАК их разводить??? В чем??? Какие стоковые растворы???
Поделитесь, пожалуйста, информацией!!!
wall.gif wall.gif wall.gif wall.gif wall.gif wall.gif wall.gif wall.gif
Участник оффлайн! Apis




 прочитанное сообщение 20.01.2010 15:45     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

Здравствуйте.
Кто-нибудь проводил выделение ДНК из пчел и ее микросателлитный анализ?
guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость



 прочитанное сообщение 22.01.2010 16:26     Сообщение для модератора       

-Здравствуйте.
Кто-нибудь проводил выделение ДНК из пчел и ее микросателлитный анализ?

Думаю кто-нибудь.... Да.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?d...$=activity

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?d...$=activity
Участник оффлайн! Надежда-27




 прочитанное сообщение 27.02.2010 12:26     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

Доброе время суток!
Уважаемые коллеги, помогите решить такой вопрос: есть старые препаратыкрови, подготовленные для кариотипирования, препраты содержались при комнатной температуре; нужно сделать FISH, но реакция гибридизации не идет. Что нужно/можно сделать, чтобы исправить ситуацию, чтобы реакция пошла?
Заранее благодарно!

(если не туда приткнула вопрос - направьте в нужный раздел, пожалуйста.)
guest: ммм
IP-штамп: frCNCa5alkkCM
гость



 прочитанное сообщение 27.02.2010 20:05     Сообщение для модератора       

Попротеазте чем нибудь ч ЭДТА конечно и тритоном что ли промойте, а после этого ставте гибридизации. Не факт что поможет, но может быть.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Надежда-27
Участник оффлайн! NBSC
Постоянный участник
Петербург



 прочитанное сообщение 27.02.2010 20:39     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail

(Privalov @ 19.01.2010 22:49)
Ссылка на исходное сообщение  Уважаемые коллеги!
Буду крайне признателен, если отзоветесь!!!
Кто-нибудь работал с определением клеток, продуцирующих цитокины на проточном цитометре?
Вся загвоздка в брефелдине-моненсине, блокирующих транспорт цитокинов через мембрану. Есть сухие, куплены в Сигме, инструкции НЕ прилагаются.
Вопрос - КАК их разводить??? В чем??? Какие стоковые растворы???
Поделитесь, пожалуйста, информацией!!!
wall.gif  wall.gif  wall.gif  wall.gif  wall.gif  wall.gif  wall.gif  wall.gif


смотри сюда -
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/Produc...RAND_KEY&F=SPEC - это брефелдин

http://www.sigmaaldrich.com/catalog/Produc...RAND_KEY&F=SPEC - это моненсин

в обоих случаях слева есть ссылка на specification sheet. Смотрим туда и видим все, что нужно.
Еще в чем проблема? Посчитать, сколько и чего разводить, надеюсь, сами сумеете?
Участник оффлайн! Надежда-27




 прочитанное сообщение 28.02.2010 10:51     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

Уважаемый guest: ммм IP-штамп: frCNCa5alkkCM, большое спасибо за Ваш ответ!

"Попротеазьте чем-нибудь ч ЭДТА конечно и тритоном что ли промойте" -
Я не биолог, поэтому нечасто приходилось заниматься такими анализами (со старыми препаратами). Если Вас не затруднит, ответьте поподробнее: какой раствор надо использовать и сколько времени надо держать препараты в нем? Можно на мейл pln-33@mail.ru
Заранее благодарна!

Сообщение было отредактировано Надежда-27 - 28.02.2010 10:58
Участник оффлайн! studenttka




 прочитанное сообщение 28.02.2010 12:48     Сообщение для модератора         Личное письмо

Здравствуйте всем! Напишите, пожалуйста, кто обсчитывал блоты и форезы (белковые) с целью количественного определения и распределения белка в дорожке и в полосе. Я пытаюсь это сделать с помощью LabImage 1D Kapelan, но в доступной демо версии нельзя (или я не могу?) проанализировать свои гели и блоты, так как их нельзя загрузить...Не знаю, что делать. Помогите, пожалуйста!!!!
guest: ммм
IP-штамп: frKx.BJzj62lY
гость



 прочитанное сообщение 28.02.2010 14:33     Сообщение для модератора       

-Я не биолог, поэтому нечасто приходилось заниматься такими анализами (со старыми препаратами). Если Вас не затруднит, ответьте поподробнее: какой раствор надо использовать и сколько времени надо держать препараты в нем? Можно на мейл pln-33@mail.ru

Это бессмыслено. Универсального решения и подхода не существует.

Могу только перечислить наиболее часто используемые ферменты.
Трипсин, Протеиназа К, Проназа, Пепсин.

По поводу оптимальных условий работы ферментов обратитесь к соответствующим справочным данным.

По поводу времени обработки и концентрации фермента обсуждать это бессмысленно их надо просто подбирать.

К тому же, как я написал выше, в результате может просто ничего не получиться.
Liudmila
IP-штамп: frpzMrmKUuRMg
гость



 прочитанное сообщение 16.06.2010 00:17     Сообщение для модератора       

как приготовить окрашенный протеиновый маркер?
Liudmila
IP-штамп: frpzMrmKUuRMg
гость



 прочитанное сообщение 16.06.2010 00:19     Сообщение для модератора       

(Liudmila @ 16.06.2010 00:17)
Ссылка на исходное сообщение  как приготовить окрашенный протеиновый маркер?


Дорогие коллеги,

Может ли кто-нибудь подсказать, как приготовить домашний окрашенный заранее протеиновый маркер? лаборатории

Спасибо!
Людмила.
Участник оффлайн! A Chemist
Постоянный участник
Минск



 прочитанное сообщение 17.06.2010 22:38     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

Может ли кто-нибудь подсказать, как приготовить домашний окрашенный заранее протеиновый маркер? лаборатории

заранее окрашенный?
или
заранее протеиновый?
у Вас есть протеиновый маркер? смесь белков? и Вы хотите сделать его (ее) окрашенным? сами? какого цвета? купите NHS нужного красителя....
альтернатива: сделайте соль диазония из аминобензойной кислоты или купите Fast Black...
и промодифицируйте смесь, предварительно ее подщелочив.
напоследок обессоливание, т.е., удаление низкомолекулярных в-в

Сообщение было отредактировано A Chemist - 17.06.2010 22:39
guest: ммм
IP-штамп: fr.7YrlKGSBjc
гость



 прочитанное сообщение 18.06.2010 10:03     Сообщение для модератора       

--у Вас есть протеиновый маркер? смесь белков? и Вы хотите сделать его (ее) окрашенным? сами? какого цвета?

Обычно раньше такие вещи делали порционовыми активными красителями с дихлортриазиновой группой. Только нужно помнить, что при покраске мол вес исходного белка может увеличится на несколько килодальтон в зависимости от мол веса красителя и числа связавшихся молекул красителя с белком.

--промодифицируйте смесь, предварительно ее подщелочив.
напоследок обессоливание, т.е., удаление низкомолекулярных в-в

Угу, протокол примерно такой и есть. Также следует позаботится о том что бы в щелочном буфере для модификации отсутствовали вещества с первичными и вторичными аминогруппами(например трис)
Liudmila
IP-штамп: frpzMrmKUuRMg
гость



 прочитанное сообщение 18.06.2010 21:48     Сообщение для модератора       

Спасибо за ответы! А вы могли бы сказать, как называется этот метод, чтобы было легче найти протокол в интернете?
guest: ммм
IP-штамп: fr.7YrlKGSBjc
гость



 прочитанное сообщение 18.06.2010 23:36     Сообщение для модератора       

-- А вы могли бы сказать, как называется этот метод, чтобы было легче найти протокол в интернете?

Как называется метод меченья антител FITC?

Как называется метод коньюгации антител с пероксидазой?

Как называется метод биотинилирования белка?

Никак не называется ....

ищете что-то на окраску белков активными красителями(проционами, цибкарбонами)
Участник оффлайн! АннБелла




 прочитанное сообщение 30.06.2010 14:24     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

Господа, кто-нибудь имел реально САМ дело со смешанными гелями? Имеются в виду ПААГ-агарозные, где агароза добавляется для придания ПААГ малой процентности мехмнической прочности (по Остерману). Имеется ряд проблем, хотелось бы послушать соратноиков shuffle.gif shuffle.gif
guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость



 прочитанное сообщение 30.06.2010 16:23     Сообщение для модератора       

Могу дать адрес вконтакте человека, котрый в юности этим баловался.

Помню, что, стекла(блок) пред заливкой предварительно грели в термостате. ПСА и ТЕМЕД вроде клали во много раз меньше.

Но я вам рекомендую воспользоваться волшебным полисахаридом, который есть у genseq'a. Его можно добавить в агарозный гель и у него удивительным образом повышается разрешение особенно для малых фрагментов.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): genseq
Участник оффлайн! АннБелла




 прочитанное сообщение 01.07.2010 14:22     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

Я из тех "могикан", которые НЕ в контакте. Если можно, какие-то иные контакты человека, игравшего в игрушки в детстве?... smile.gif
В принципе, фрагменты не такие малые, чтобы их не видеть. Видится всё, что надо. И делится хорошо. Проблемы иного плана, чисто "механические". Ну, и немного, наверное, по режиму самого фореза.
Участник оффлайн! RJ Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 02.07.2010 14:08     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

(guest: ммм @ 30.06.2010 17:23)
Ссылка на исходное сообщение  Могу дать адрес вконтакте человека, котрый в юности этим баловался.

Помню, что, стекла(блок) пред заливкой предварительно грели в термостате. ПСА и ТЕМЕД вроде клали во много раз меньше.

Но я вам рекомендую воспользоваться волшебным полисахаридом, который есть у genseq'a. Его можно добавить в агарозный гель и у него удивительным образом повышается разрешение особенно для малых фрагментов.

волшебный полисахарид имеется не только у генсека, но и в свободной продаже за бугром, 100 гринов за 100 г
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 04.07.2010 13:32     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес

(RJ Dio @ 02.07.2010 12:08)
Ссылка на исходное сообщение  волшебный полисахарид имеется не только у генсека, но и в свободной продаже за бугром, 100 гринов за 100 г


Называется это чудо "SYNERGEL". Способ получения запатентован 20 лет назад. Сейчас продаётся и перепродаётся многими фирмами. Сначала хотел сделать аналог, но просто копировать стало скучно. В результате на сегодняшний день имеется 3 сорта ПГМ, из которых можно получать гели самого различного разрешения. ПААГ отдыхает!

Сообщение было отредактировано genseq - 04.07.2010 13:32

Файл/ы:

скачать файл Synergel_20Flyer.pdf
размер: 386.07к
кол-во скачиваний: 4808



скачать файл ГОТОВЫЕ_ГЕЛИ_05.pdf
размер: 19.19к
кол-во скачиваний: 2374


Участник оффлайн! АннБелла




 прочитанное сообщение 05.07.2010 11:12     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

И я одинаково чётко буду видеть полосы от 2280 до 863? И 2 280 хорошо разойдётся с 2 274 при этом? И как соотносить его процентность с процентностью ПААГ? Или всё по вложенной инструкции к нему? smile.gif В 2.6 % ПААГ я всё очень чётко и хорошо вижу smile.gif Но гель 20*20 и толщина 0,75 - краситься очень весело.

Сообщение было отредактировано АннБелла - 05.07.2010 11:15
Участник оффлайн! АннБелла




 прочитанное сообщение 05.07.2010 11:25     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

И как эта чудо добавка ведёт себя в геле в присутствии мочевины, интересненько....
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 05.07.2010 12:42     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес

(АннБелла @ 05.07.2010 09:12)
Ссылка на исходное сообщение  И я одинаково чётко буду видеть полосы от 2280 до 863?  И 2 280 хорошо разойдётся с 2 274 при этом? И как соотносить его процентность с процентностью ПААГ? Или всё по вложенной инструкции к нему? smile.gif В 2.6 % ПААГ я всё очень чётко и хорошо вижу smile.gif Но гель 20*20 и толщина 0,75 - краситься очень весело.


Чёткость нормальная, но насчёт разделения 2280 и 2274 не уверен. Нужно пробовать с большим пробегом, а мы гоняем исключительно на коротких дистанциях, в толстых гелях (4мм) и в горизонтальных камерах. На вертикальных тонких гелях картинки должны получаться чётче.

Что касается разрешения, то для Ваших целей может подойти ПА-2 (0,8% агарозы + 0,6% ПГМ-1). На картинке показан форез маркёров М50, М100 и М200 на геле ПА-4 (ПА-2 + 1% ПГМ-2) , имеющем не самое высокое разрешение. Левая дорожка - лямбда (рестрикты HindIII). Для сравнения рядом разделение тех же рестриктов на 0,7% агарозе (видна парочка 2027 с 2322 и 564, а все крупные фрагменты на малом пробеге не делятся).

Мочевину не пробовали, но на агарозных гелях с мочевиной люди работают, а на полигалактоманнан она влиять не должна.

Если нужна инструкция по добавлению ПГМ, то напишу, но мне проще сварить гель самому. Можем поставлять гели не в готовом к употребления виде (с лунками), а в полипропиленовых стаканах. Остаётся разогреть в микроволновке и залить прибор.

Сообщение было отредактировано genseq - 05.07.2010 12:46

Картинки:
картинка: ПА_4_форез_маркеров.JPG
ПА_4_форез_маркеров.JPG — (19.98к)   

Участник оффлайн! АннБелла




 прочитанное сообщение 05.07.2010 13:49     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

Ну вот картинка в обычной 2% агарозе без ничего.
user posted image
Хорошо видны нижние фрагменты 982 и 863. Неплохо в серединке разделились 1410, 1497 и 1701. А вот 2280, 2274 и 2151 идут, естественно в таком проценте одной полосой. В просто АА (процент от 2,6 до 3,0) разгоняется великолепно и чётко абсолютно всё. Но красить эти гели.......
На вашей картинке я вижу, что фрагменты меньше 2000 я буду видеть очень плохо, или же придётся перегружать лунки, тогда большие фрагменты будут сливаться. И разница у близкоидущих полос слишком велика, 2280 и 2 274 не разделяться точно...
В 0,7-0,8% агарозе тоже делали, мелкие не видны вовсе.
Про длину пробега тоже мысль была. Одна из первых smile.gif Гоняли в большой горизонтальной камере - ничего подобного! Не разбегаются, так и идут табуном по всей длине.

Сообщение было отредактировано АннБелла - 05.07.2010 13:59
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 05.07.2010 14:12     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес

Нечёткость верхних полос у М100 и М200 проявляется из-за того, что гели сфотографированы с близкого расстояния и краевые полоски смотрятся под углом. У тонких гелей это не проявляется. Что касается разрешения гелей, то оно подбирается на любой вкус. Для каждого диапазона длин фрагментов оптимум свой.

По поводу Вашего геля. Это очень плохо сфотографировано, или мочевина с агарозой дают такую мазню?
Участник оффлайн! АннБелла




 прочитанное сообщение 05.07.2010 14:22     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

Ни то и ни другое. Это зверский УФ, который сжирает картинку в считаные минуты.
Участник оффлайн! АннБелла




 прочитанное сообщение 05.07.2010 14:26     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

Ну вот что бы вы посоветовали для чёткого разделения следующих фрагментов: 2280, 2274, 2151, 1701, 1497, 1410, 982 и 863. При том условии, что само по себе чёткое разделение этих фрагментов не самоценно, а необходимо выявлять разницу между аналогичными полосами в разных пробах. Разница будет минимальной - от 1пары оснований. Да, забыла сказать, речь идёт об РНК smile.gif
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 05.07.2010 18:38     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес

Советовать нужно исходя из собственного опыта, а я с РНК не работал. Если исходить из теоретических предпосылок, то разницу в 1 нуклеотид на пробеге в 20 см Вы на этом спектре фрагментов не увидите. Отличие в 6N (2280-2274) увидеть вполне реально, но придётся экспериментировать с несколькими вариантами гелей. Не уверен, что сочетание агарозы с ПГМ и мочевиной нормально перенесёт окрашивание. Если есть желание поэкспериментировать, то ПГМ обеспечу. Но в Вашем случае, наверное, лучше не экспериментировать, а тупо следовать протоколу с гелем агароза-ПААГ. Опыт приготовления таких гелей имеется, но для наших горизонтальных гелей использовать ПГМ намного проще.

Прежде всего, Вы должны иметь термостат на 40...45 градусов, поскольку все растворы должны быть тёпленькими. В расплав 1% агарозного геля вливаете требуемый объём концентрата акриламид/метиленбисакриламид (29:1). Персульфат и ТЕМЕД можно добавить перед самым смешиванием в агарозу, а ещё лучше персульфат в агарозу, а ТЕМЕД в акриламид (или наоборот). Добавлять их нужно в 4...5 раз меньше нормы. Главное - очень быстро и очень тщательно перемешать и тут же залить в прибор, который перед заливкой также лучше держать в термостате. Если заполимеризуется слишком быстро, то возьмите ещё меньше персульфата и ТЕМЕДа.

Главное в этом деле - навык, а для его приобретения несколько гелей придётся испортить.
Участник оффлайн! АннБелла




 прочитанное сообщение 06.07.2010 13:01     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

Да гель приготовить - нет проблем. И термостат, и смешивание в тёплом виде, и диаэрация, и концентрация ТЭМЕД и ПСА, и граница застывания видна очень наглядно - всё это известно, всё делается. И сам гель замечательный получается, очень удобный в работе. И вариантов и сочетаний перепробовано тысяча и одна smile.gif
В просто ПААГ, без агарозы отличие в 6N видно великолепно. Можно увидеть и меньше, исходя из того расстояния, которое видимо между фрагментами, отличающимися в эти 6N. А вот в смешанном геле полосы размываются, видны не очень чётко. Работаю по Остерману, а у него методика дана довольно размыто. Например, он рекомендует после застывания основного геля и срезания границы заливать сверху агарозу 0.3%, в которой формируются карманы. Ну не липнет она к основному гелю! С гребёнкой кусками выходит. Делала и 0.5% (как в основном геле) и 0,4% - вроде всё нормально, формируются карманы, пробы вносятся хорошо. Но после прокрашивания становится очевидно, что при прохождении границы гелей размывается оно на все ближайшие лунки. Делала верхний гель из ПААГ - та же история. Делала гели без мочевины - полосы очень нечёткие, хотя РНК растворена в формамиде и в геле присутствует ещё и SDS. Варьировала вольтаж и температуру - никакого эффекта. Обычно камера с гонющимся форезом у меня живёт в холодильнике. Пробовала без охлаждения - ещё больше размывает.
В принципе, можно работать на ПААГ без агарозы - там нет вопросов, всё очень хорошо и замечательно. Кроме момента прокрашивания. Надо быть просто хирургом высшей квалификации, чтобы красить в серебре гель 20*20, 0.75мм и 2,6% ПААГ frown.gif((
guest: ммм
IP-штамп: frKx.BJzj62lY
гость



 прочитанное сообщение 06.07.2010 13:31     Сообщение для модератора       

--он рекомендует после застывания основного геля и срезания границы заливать сверху агарозу 0.3%, в которой формируются карманы. Ну не липнет она к основному гелю! С гребёнкой кусками выходит. Делала и 0.5% (как в основном геле) и 0,4% - вроде всё нормально, формируются карманы, пробы вносятся хорошо.

Почему вы не заливаете гель и сразу гребенку в него,зачем такие сложности.

--В принципе, можно работать на ПААГ без агарозы - там нет вопросов, всё очень хорошо и замечательно. Кроме момента прокрашивания. Надо быть просто хирургом высшей квалификации, чтобы красить в серебре гель 20*20, 0.75мм и 2,6% ПААГ ((

Могу лишь посоветовать сделать много-много биса. Например 2% АА и 1% Биса
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 06.07.2010 13:43     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес

Тогда всё проще. Нужно работать на чистом ПААГ, но как-то решить проблему его окрашивания. Это не так уж и сложно. На стекло наносите винилтриэтоксисилан. Можно раствор в ацетоне, а можно и без растворителя. Достаточно смочить сторону, прилегающую к гелю. Он пришивается к стеклу и активирует поверхность винильными группами. Промываете водой, сушите и всё. К этой поверхности тонкий гель в процессе полимеризации пришивается, причём ковалентно. Держится намертво. Гель будете красить прямо на стекле. Потом немного помучаетесь, сдирая гель со стекла, но это можно и стерпеть.

Если винилтриэтоксисилан отсутствует, подойдёт и более распространённый АПТЭС (аминопропилтриэтоксисилан), но его нужно будет обработать ещё глицидилметакрилатом. Остаётся только добыть требуемые реактивы. Если Вы за бугром, то ничем не могу помочь. Если в Москве, то могу подсказать, где их можно купить. Если в Пущино, то заходите. Налью beer.gif .

Успехов!
guest: ммм
IP-штамп: frKx.BJzj62lY
гость



 прочитанное сообщение 06.07.2010 14:07     Сообщение для модератора       

-Потом немного помучаетесь, сдирая гель со стекла, но это можно и стерпеть.

Стекол не напасешси.

Уж лучше модифицировать ПЭТ пленку, или подложку из полистирола.

Тогда проблема отдирания отпадет сама собой.
Участник оффлайн! АннБелла




 прочитанное сообщение 07.07.2010 16:02     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

Почему вы не заливаете гель и сразу гребенку в него,зачем такие сложности.

А вы попробуйте хоть раз! smile.gif))))
Поскольку агарозе в смешанном геле положено застывать раньше, чем ПААГ (отсюда и хитрости с подбором концентрации ТЭМЕД и ПСА), то и правильность приготовления такого геля подтверждается образованием характерной границы при застывании. Она напоминает шхеры и фьорды на карте Норвегии smile.gif И если опустить гребёнку сразу (что, кстати, и делалось ради прикола), то весь этот сюр образуется вокруг зубцов. Старик Остерман про это предупреждает. До того, чтобы посмотреть, какие при этом будут полосы, мои приколы не не дошли smile.gif
Гели на стекле я красила. Это первое, что приходит в голову. Честно говоря, не очень понравилась степень прокрашивания. Но попробовать один раз "пришить его
ковалентно" и возможно, подувеличить насыщенность растворов серебра и проявителя попробовать можно. И хочется посмотреть, потеряю я стекло после этого, или нет. Есть у меня парочка покоцаных, могу пожертвовать ради науки smile.gif


Если в Москве, то могу подсказать, где их можно купить. Если в Пущино, то заходите. Налью .
Я в Питере smile.gif
В Пущино бывать доводилось, месяцок там жила smile.gif


В любом случае, спасибо всем за живейшее участие!

Сообщение было отредактировано АннБелла - 07.07.2010 16:05
Liudmila
IP-штамп: frpzMrmKUuRMg
гость



 прочитанное сообщение 05.08.2010 18:05     Сообщение для модератора       

Дорогие коллеги,
Кто-нибудь определял уровень фосфорилирования белков вестерн-блоттингом? У меня методика упорно не работает: уровень фосфорилирования оказывается многократно ниже, чем должно быть. Обращаюсь с белками как для обычного вестерн-блота. Куда могут деться фосфатные группы?
Спасибо за любые предположения!
Участник оффлайн! Tom1
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 05.08.2010 18:28     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail

(Liudmila @ 05.08.2010 08:05)
Ссылка на исходное сообщение  Дорогие коллеги,
Кто-нибудь определял уровень фосфорилирования белков вестерн-блоттингом? У меня методика упорно не работает: уровень фосфорилирования оказывается многократно ниже, чем должно быть. Обращаюсь с белками как для обычного вестерн-блота. Куда могут деться фосфатные группы?
Спасибо за любые предположения!

1. Что вы имеите ввиду говоря об уровне фосфорелирования???? Типа количественный анализ с помощью щестерна??????
2. Чем красите??? просто антителами на белок????? или специфическими к фосфопептидам или же на фосфо-аминокилоты??????
3. В когда получаите образцы ( до варки) в буфере присуствуют ингибиторы фосфотаз и какие???????
Liudmila
IP-штамп: frpzMrmKUuRMg
гость



 прочитанное сообщение 05.08.2010 19:16     Сообщение для модератора       

Tom1, спасибо за внимание!
1.Оцениваю увеличение фосфорилирования качественно, на глазок.
2.Использую антитела к фосфопептидам.
3. Да, присутствуют: использую апротинин, леупептин, ортованадат и PMSF. Несколько лет назад эта методика работала в этой же научной группе, а теперь в моих руках - не получается.
Обнаружила в интернете, что в случае антител против фосфопептидов надо использовать БСА вместо молока на всех этапах обработки блота, а я использовала молоко в случае вторичного антитела. Неужели это имеет значение?!

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 26.05.17 14:10
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft