Rambler's Top100
 		Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ

Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Проблема с обратной транскипцией
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.

 
 Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! tutonka
Участник
 прочитанное сообщение 01.10.2013 09:58     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование
Вопрос
Здравствуйте,
У меня в последнее время появились проблемы с обратной транскрипцией. До этого все было хорошо, а потом она либо перестала бежать либо идет неэффективно (т.е. на последующем ПЦР бэнды есть, но они очень блеклые, а с ПЦР я ставила контроли - ПЦР в порядке). Проблемы с реагентикой для обратной транскрипции, конечно, могут быть, но основные вещи мы проверили, и они работают. Остается РНК. Форез - на картинке (он не по правилам, а в обычном агарозном геле). Не подскажите, это нормальная РНК (мышь)? И на что еще стоит обратить внимание?
Спасибо!
DSCN0909.JPG - кликните, чтобы открыть увеличенную картинку
Участник оффлайн! R.J.Dio
Постоянный участник
 прочитанное сообщение 01.10.2013 12:43     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование
РНК великолепная, рибосомалка как слеза комсомолки, развала внизу нет. Ищите проблему в реактивах. Может, вода с DEPC?
Участник оффлайн! tutonka
Участник
 прочитанное сообщение 01.10.2013 14:23     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование
Спасибо.
Участник оффлайн! tutonka
Участник
 прочитанное сообщение 01.10.2013 14:27     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование
А с водой часто бывают проблемы? И не могут ли это быть примеси при выделении РНК, которые ингибируют реакцию?
Участник оффлайн! R.J.Dio
Постоянный участник
 прочитанное сообщение 01.10.2013 15:01     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование
какие примеси? При стандартном выделении после спирта все должно уходить. А вода? Ну. у Вас Милли-ку, я полагаю. Только DEPC не лейте, и все будет в порядке
Участник оффлайн! tutonka
Участник
 прочитанное сообщение 01.10.2013 20:39     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование
А почему не DEPC? ПЦР он ингибирует, но ведь для обратной транскрипции используется именно он. А про примеси - говорят, что могут быть следы фенола, но я вот не знаю, как они действуют на обратную транскрипцию
Участник оффлайн! R.J.Dio
Постоянный участник
 прочитанное сообщение 02.10.2013 11:12     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование
DEPC как раз и ингибирует РТ, именно так!!! Тут у вас, похоже, собака и порылась
Участник оффлайн! tutonka
Участник
 прочитанное сообщение 02.10.2013 14:16     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование
Как это? DEPC прописан в протоколах производителя. (в приложении) И раньше-то все работало много раз.

Файл/ы:

скачать файл Reverse_transcriptase_M_MuLV__EPO0441.pdf
размер: 79.02к
кол-во скачиваний: 831

Участник оффлайн! R.J.Dio
Постоянный участник
 прочитанное сообщение 02.10.2013 18:22     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование
посмотрите внимательно, DEPC- общеизвестно, надо удалять, то ли дать воде постоять, то ли автоклавировать- он разрушается нагреванием. На самом деле, нормальная MilliQ без РНКаз, и не надо никаких DEPC
Участник оффлайн! tutonka
Участник
 прочитанное сообщение 03.10.2013 10:43     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование
Под DEPC water я и подразумевала, что после инкубации DEPC был разрушен автоклавированием. Так что самого DEPC в этой воде не должно быть. А вы работаете просто с MilliQ? А почему? Исторически так сложилось?
Участник оффлайн! R.J.Dio
Постоянный участник
 прочитанное сообщение 03.10.2013 11:52     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование
а потому что надо работать чисто, тогда никих DEPC не надо будет. Обычная история- DEPC недо развалился после автоклавирования, и Вы имеете то, что имеете. Или кто там кого имеет
Участник оффлайн! tutonka
Участник
 прочитанное сообщение 03.10.2013 13:01     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование
Последнее на самом деле ближе к правде...)
Спасибо за помощь, попробую его заменить - может и правда в нем дело.
Участник оффлайн! Бору
Постоянный участник
Киев. обл., Украина
 прочитанное сообщение 03.10.2013 18:59     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  ICQ
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование
Мы работаем с РНК-вирус диагностикой. Один раз ставили анализ на стороне в лаборатории где студенты периодически проходят практику, без УФ-лампы, работали тогда без перчаток. Да, и на российских китах. Результат положительный, подтвержден внутренним к. Зачем вообще ДЭПК?
Guest
IP-штамп: frQCpGSFifrEU
гость
 прочитанное сообщение 03.10.2013 19:41     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #14 множественное цитирование
Без какой уф-лампы? какие в баню рос.наборы?
Чудесная рнк. Вряд ли нагадили при хранении. Уберите дэпк. Чистите дозаторы "специяльными средствами", если очень ценный материал. И аккуратно руудуйте лапками smile.gif
Guest
IP-штамп: frQCpGSFifrEU
гость
 прочитанное сообщение 03.10.2013 19:42     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #15 множественное цитирование
сравнил вирусы с экспрессией
Участник оффлайн! xenopus
Постоянный участник
Moscow
 прочитанное сообщение 03.10.2013 22:14     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #16 множественное цитирование
(R.J.Dio @ 02.10.2013 16:22)
Ссылка на исходное сообщениеНа самом деле, нормальная MilliQ без РНКаз, и не надо никаких DEPC


+100500! Святая правда. И не надо работать в одной комнате (и тем более одними сэмплерами) с РНК и РНКазами, например плазмиды выделять.
Участник оффлайн! Бору
Постоянный участник
Киев. обл., Украина
 прочитанное сообщение 04.10.2013 00:55     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  ICQ
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #17 множественное цитирование
frQCpGSFifrEU Бактерицидная лампа в лабе для выделения РНК и отдельно приготовления ПЦР смеси. Как у нас на работе. 30 минут включаем предварительно. Российские наборы - конкретно киты от ИЛС.
Участник оффлайн! Бору
Постоянный участник
Киев. обл., Украина
 прочитанное сообщение 04.10.2013 01:01     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  ICQ
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #18 множественное цитирование
Эксперссию - согласен. Тоже делали - там дело на минуты идет, распадается иРНК. И Без ДЭПКа никак

Сообщение было отредактировано Бору - 04.10.2013 01:38
Участник оффлайн! tutonka
Участник
 прочитанное сообщение 14.10.2013 23:33     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #19 множественное цитирование
Мы все таки нашли проблему. Оказалось, что дело не в DEPC. Наша обратная транскриптаза не могла работать с нашими dNTP. По отдельности - все работает, с этими dNTP я прекрасно ставлю ПЦРы, обратная транскриптаза работает сейчас. Но только не вместе. Говорят, что это случается.
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва
 прочитанное сообщение 15.10.2013 10:28     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #20 множественное цитирование
(tutonka @ 15.10.2013 00:33)
Ссылка на исходное сообщение  Мы все таки нашли проблему. Оказалось, что дело не в DEPC. Наша обратная транскриптаза не могла работать с нашими dNTP. По отдельности - все работает, с этими dNTP я прекрасно ставлю ПЦРы, обратная транскриптаза работает сейчас. Но только не вместе. Говорят, что это случается.

Это что-то новое! Этих трифосфатов для ОТ добавляется такой избыток по сравнению с ПЦР, что примеси должны быть убийственными. Может все-таки что-то с самой транскриптазой.
Идеальная РНК! Видимо, мыши еще тепленькие были. Каким набором (методом) выделяли?
Участник оффлайн! R.J.Dio
Постоянный участник
 прочитанное сообщение 15.10.2013 11:24     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #21 множественное цитирование
потому что не надо экономить на копейках! Буквы должны быть хорошими. Возможно, они были в виде аммониевых солей, это могла ингибировать ОТ
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва
 прочитанное сообщение 15.10.2013 12:58     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #22 множественное цитирование
(R.J.Dio @ 15.10.2013 12:24)
Ссылка на исходное сообщение  потому что не надо экономить на копейках! Буквы должны быть хорошими. Возможно, они были в виде аммониевых солей, это могла ингибировать ОТ

Когда-то отрабатывал однопробирочный ОТ-ПЦР и в связи с этим проверял влияние сульфата аммония на ОТ, до 10 мМ - полет был нормальный, т.е. подавления ОТ не было.
Я допускаю, что при идеальной РНК, возможно, все-таки были ингибирующие примеси в препарате. Как выделялась РНК?
Участник оффлайн! tutonka
Участник
 прочитанное сообщение 17.10.2013 10:18     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #23 множественное цитирование
Обычный протокол с тризолом, никаких отступлений. После выделения я ее переосаждала, так что примесей не должно быть, по идее.
Участник оффлайн! tutonka
Участник
 прочитанное сообщение 17.10.2013 10:21     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #24 множественное цитирование
(-Ъ- @ 15.10.2013 11:28)
Ссылка на исходное сообщение  Это что-то новое!  Может все-таки что-то с самой транскриптазой.



Транскиптаза прекрасно работает - с новыми dNTP - все просто супер.
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва
 прочитанное сообщение 17.10.2013 10:36     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #25 множественное цитирование
(tutonka @ 17.10.2013 11:21)
Ссылка на исходное сообщение  Транскиптаза прекрасно работает - с новыми dNTP - все просто супер.

Чем все-таки отличаются старые трифосфаты от новых? Один источник, одни натриевые соли, кто производитель трифосфатов и тризола? Простите, что пристал - это должно быть всем интересно. smile.gif
Участник оффлайн! R.J.Dio
Постоянный участник
 прочитанное сообщение 17.10.2013 10:50     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #26 множественное цитирование
да-да, весьма интересно
Участник оффлайн! tutonka
Участник
 прочитанное сообщение 17.10.2013 12:11     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #27 множественное цитирование
Trizol reagent life technologies 15596026

А вот с dNTP - точно не могу сказать. Проблема в том, что я не придавала этому значения, взяла их у шефа, смешала - и в дело. Они были из запасов. Могу сказать только, что сейчас отлично работают helicon.
Участник оффлайн! comp3v
Постоянный участник
Москва
 прочитанное сообщение 17.10.2013 12:20     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #28 множественное цитирование
(tutonka @ 17.10.2013 13:11)
Ссылка на исходное сообщение А вот с dNTP - точно не могу сказать. Проблема в том, что я не придавала этому значения, взяла их у шефа, смешала - и в дело. Они были из запасов. Могу сказать только, что сейчас отлично работают helicon.
Хеликон начал производить собственные нуклеотиды?! eek.gif
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва
 прочитанное сообщение 17.10.2013 13:49     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #29 множественное цитирование
(comp3v @ 17.10.2013 13:20)
Ссылка на исходное сообщение  Хеликон начал производить собственные нуклеотиды?!  eek.gif

Не думаю. Купили балком, аликвотировали и заморозили - вот и собственное производство. Я тоже так делаю. smile.gif
Возможно у них от Ферментаса или Инвитрогена.
Участник оффлайн! R.J. Dio
Постоянный участник
 прочитанное сообщение 19.10.2013 23:44     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #30 множественное цитирование
Чтоб модератор не дремал- повторяю для тех, кто на броневике- скорее всего, в НовоСибе сварены буквы
Участник оффлайн! Кутх
 прочитанное сообщение 21.10.2013 21:26     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #31 множественное цитирование
Обратная транскриптаза более чувствительна ко многим ингибиторам, чем Taq. Поэтому в данном случае ПЦР идёт нормально, а RT дохнет. Кстати, какую транскриптазу используете - M-MLV, AMV или ещё какую?
P.S. А трифосфаты явно недочищенные.
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва
 прочитанное сообщение 22.10.2013 09:52     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #32 множественное цитирование
(Кутх @ 21.10.2013 22:26)
Ссылка на исходное сообщение  Обратная транскриптаза более чувствительна ко многим ингибиторам, чем Taq. Поэтому в данном случае ПЦР идёт нормально, а RT дохнет. Кстати, какую транскриптазу используете - M-MLV, AMV или ещё какую?
P.S. А трифосфаты явно недочищенные.

Всю ветку читайте, а не первый пост. И на все вопросы найдете ответы.
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва
 прочитанное сообщение 22.10.2013 10:00     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #33 множественное цитирование
(R.J. Dio @ 20.10.2013 00:44)
Ссылка на исходное сообщение  Чтоб модератор не дремал- повторяю для тех, кто на броневике- скорее всего, в НовоСибе сварены буквы

Всю жизнь пользовался Новосибом. Да, были проблемы в начале 90-х (dGTP плохо растворялся, вернее выпадал после размораживания 100 мМ), но потом исправились. А в последнее время я с жиру бешусь и покупаю более чистые. shuffle.gif Но что странно, разницы особой не вижу так на 0,5-1,5 цикла. Так же и в ОТ.
Участник оффлайн! R.J. Dio
Постоянный участник
 прочитанное сообщение 22.10.2013 12:14     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #34 множественное цитирование
потому что проверять буквы надо не совсем так, тогда хорошее от лучшего будет разниться существеннее
Участник оффлайн! watchesbiz
Постоянный участник
 прочитанное сообщение Сообщение на английском  04.12.2021 08:38     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #35 множественное цитирование
https://wanelo.co/replicarolexwatches
https://musescore.com/fakerolexwatches
https://www.racked.com/users/Replicarolexwatches
https://sketchfab.com/Rolexrelicawatches
http://www.video-bookmark.com/bookmark/433...eplica-watches/
https://www.slideserve.com/ReplicawatchesUK...pt-presentation
https://www.theverge.com/users/Replicarolexwatches
https://www.yumpu.com/en/document/read/6532...lica-watches-uk
https://online.flippingbook.com/view/152275247/
https://www.instapaper.com/p/8767342
https://www.bigblueview.com/users/Replicarolexwatches
https://weheartit.com/watcheshutuk
https://sites.google.com/view/replicarolexwatches24/home
https://www.indiehackers.com/post/hints-on-...atch-113aef73a9
http://replicawatchesuk.esportsify.com/for...ica-rolex-watch
Участник оффлайн! watchesonline89
Постоянный участник
 прочитанное сообщение Сообщение на английском  28.12.2022 11:18     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #36 множественное цитирование
https://62e8ce2ae5d50.site123.me/
https://www.vingle.net/posts/4647029
https://eatsleepride.com/c/383272
https://anotepad.com/notes/prkpsawt
https://demo.wowonder.com/1665548793521727_195426
https://linktr.ee/omegawatches89
https://omegawatches89.gumroad.com/p/reason...replica-watches
https://omegawatches93.mystrikingly.com/
https://writer.zoho.com/writer/open/k3enw04...fea14e95e0ee806
https://www.edocr.com/v/rakkz4oq/omegawatch...-replica-online
https://diigo.com/0pigfx
https://62e8ce2ae5d50.site123.me/blog/reaso...replica-watches
https://www.worldranklist.com/preview/bookm...s-Online-Store-
https://omegawatches89-95.webselfsite.net/contact
https://form.jotform.com/223252982096057

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики 		Назначение кнопок:
   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -  
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 16.04.24 18:02
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft
Powered by Invision Power Board(Trial) v2.0.0 © 2024  IPS, Inc.