Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
SkyGen Участник Москва |
Под доступностью мы понимаем цены близкие или равные европейским, собственный склад реактивов и оборудования, доставку за 1-3 дня в любой крупный город России. Иными словами, мы делаем все возможное, чтобы поставить Вам качественную продукцию, недорого и быстро. Мы начали с New England Biolabs и у нас получилось! Мы верим в то, что чтобы быть близким к Вам, недостаточно просто выставлять счета и осуществлять доставку. «Логистических» и «каталожных» компаний много и все они известны. Нам же важно глубоко разобраться в теме и быть поддержкой для Вас. Для этого мы публикуем новости, обзоры и высоко ценим любые замечания и критику. Каждый продукт мы «пропускаем» через себя. Анализируем плюсы и минусы, представляем, как и где он будет работать, консультируемся с Вами. И, как результат, создаем методички, семинары и презентации. Мы стараемся угнаться за Вами в научном познании мира, мы стараемся учиться и расти вместе с Вами. Даже уйдя из науки, мы все равно остались в душе искателями и открывателями. Пусть наша работа будет полезна Вам - и в этом мы видим свою реализацию. Мы являемся официальными дистрибьюторами New England Biolabs, QIAGEN, Agilent Technologies, Oxford Nanopore Technologies, 10x Genomics, Macherey-Nagel, NIMAGEN, IDT, Thermo Scientific, SIGMA-ALDRICH, ChemGenes, Bio Molecular Systems, Gilson. У нас есть сервисная служба. Мы осуществляем обслуживание, калибровку и поверку дозаторов, лабораторных весов и ПЦР-амплификаторов различных производителей, а также занимаемся организацией валидации оборудования IQ/OQ. Сообщение было отредактировано SkyGen - 12.02.2018 15:54 |
SkyGen Участник Москва |
Часто ли вы оказывались в такой ситуации, когда исчезающе малые количества исходного материала не позволяют думать о продолжении экспериментов? Существуют также ситуации, когда важно использовать ДНК одной единственной клетки. Сегодня все это стало возможно, благодаря появлению новых, высокопродуктивных ДНК-полимераз. Метод полной амплификации генома клетки особенно актуален для изучения эмбрионального развития, дифференциации стволовых клеток, нейронов и разработки новых подходов для лечения опухолевых заболеваний. Всем, а особенно тем, кому такие возможности приоткрывают новые двери для шага вперед в их исследованиях, мы расскажем в нашем обзоре про В каком направлении должны были двигаться исследователи, чтобы иметь возможность увеличить то мизерное количество ДНК и РНК, которое можно получить из одной единственной клетки в миллионы раз и получить количество, достаточное для анализа? Для решения каких задач возможно использовать набор для полной амлпификации генома клетки? 1. Анализ вариаций числа копий (Copy Number Variation, CNV) 2. SNP генотипирование 3. Детекция мутаций 4. Секвенирование Принцип метода полной амлпификации генома клетки (WGA) Набор для полной амплификации генома клетки PicoPLEX™ WGA Kit позволяет эффективно амплифицировать целиком ДНК, содержащуюся в одной клетке, до суммарного количества в 2-5 мкг за 3 часа (в результате протокола происходит увеличение количества исходной ДНК в 1 миллион раз). Длина получаемых при помощи набора ампликонов варьирует от 200 до 1000 п.н. Рис.1. Последовательность действий при проведении 3-х шагового протокола амплификации генома одиночной клетки или 15 пг - 15 нг ДНК.</i> Какие преимущества дает использованием методики полногономной амплификации клетки (WGA)? 1. Возможность амплификации генома отдельно взятой клетки. Эффективность амплификации единичного бластомера и полярных телец достигает 95%. 2. Набор может быть также применен при необходимости амплификации неопределенного малого количества исходного материала (от одной до тысячи клеток или от нескольких пикограмм до нескольких нанограмм ДНК). 3. Метод позволяет одинаково успешно амлифицировать как AT-, так и GC-богатые регионы. 4. Высокая воспроизводимость: коэффициент корреляции между значениями Ct при повторных ПЦР в реальном времени достигает 90%. 5. Специфичность и высокая эффективность метода могут быть наглядно проиллюстрированы (Рис.2.), когда мы сравним рост кривых амплификации одиночного клеточного генома и отрицательного контроля: нарастание сигнала в пробирках с отрицательным контролем происходит с отставанием, как минимум, в 5 ПЦР-циклов. [i] Рис.2. Амплификационные кривые, полученные при проведении ПЦР при помощи набора для полной амплификации генома клетки в режиме реального времени на приборе Bio-Rad I Cycler iQ. Другим примером эффективности работы может служить электрофореграмма разделения продуктов ПЦР после использования набора WGA (Рис.3). Рис. 3 Электрофореграмма разделения продуктов ПЦР в 1,4% агарозном геле. Дорожка 1: отрицательный контроль, дорожки 2 и 3: продукты двух независимых реакций с использованием 15 пг геномной ДНК человека, М: Маркер 2-Log 0.1-10 т.п.н. длин ДНК. Амплификация полного генома отдельной клетки для последующего секвенирования NGS Давайте вместе посчитаем: в одной клетке находится 70-100 пг ДНК и порядка 10 пг тотальной РНК (что составит 0,1-0,5 пг мРНК). Для того, чтобы, например, приготовить ДНК библиотеку для NGS с помощью набора NEBNext для Illumina, нам потребуется 1-5 мкг ДНК (в случае набора NEBNext Ultra - 5 нг-1 мкг). Значит, при условии увеличения количества ДНК в 10 000 раз возможно будет создать библиотеку NGS. Для РНК задача усложняется: для использования набора NEBNext для создания библиотеки потребуется 100 нг-1мкг тотальной РНК (10 нг-1 мкг для набора Ultra). Получаемое количество ДНК после использования набора, даже с учетом потерь на очистку, достаточно для проведения NGS эксперимента. Cостав набора 1. Фермент для экстракции ДНК 2. Фермент для подготовки к амплификации 3. Фермент для амплификации 4. Буфер для экстракции 5. Буфер для разведения фермента для экстракции 6. Реакционная смесь для подготовки к амплификации 7. Реакционная смесь для амплификации 8. Очищенная от нуклеаз вода 9. Температура хранения: -20°С Примечания: Пробирки с ферментами следует доставать из холодильника и ставить на планшет со льдом только перед непосредственным их использованием. Остальные компоненты набора можно размораживать на планшете со льдом, а перед использованием их следует перемешать при помощи вортекса. Набор для полной амплификации генома клетки предполагает работу со сверхнизкими (пикограммы) количествами ДНК, поэтому при работе с ним необходимо соблюдать особую осторожность для предотвращения возможной контаминации. Мы надеемся, что представленная в данном обзоре информация будет полезна, и поможет вашей работе! Со всеми вопросами и предложениями (в том числе по тематикам обзоров, которые интересные) обращайтесь по электронной почте info@skygen.com, и по телефонам: +7 (495) 215 02 22; +7 (800) 333 12 26 Сообщение было отредактировано SkyGen - 31.03.2015 19:38 |
страницы (9): 1 2 3 > » |