Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Clouds |
Приобрели кит для silver staining (Amersham Biosciences). В инструкции к киту написано, что его можно использовать для окраски гелей содержащих SDS и мочевину. При окрашивании этим китов геля содержащего SDS и мочевину получили низкую чувствительность окрашивания: 100нг против обещаных 0,2-0,6нг. Методика кита основана на статье Heukeshoven J., Demick R. Electrophoresis 6(1985): fixation:этанол-уксусная - 30 мин; sensitizing: этанол, глютаральдегид тиосульфат натрия, ацетат натрия - 30мин; washing: mQ вода3*5 мин; silver reaction: нитрат серебра, формальдегид - 20 мин; washing:mQ вода 2*1 мин; developing: карбонат натрия, формальдегид - 2-5 мин (я держала намного больше, чтоб хоть что-то проявилось). Длительная отмывка геля от SDS не проводилась т.к. об этом в ките ничего небыло написано. Сама окраска проводилась строго по иструкции если не считать увеличения времени проявки. Как можно увеличить чувствительность окраски? |
Oleg Klychnikov Постоянный участник Moscow/Amsterdam->Leiden |
обычно, из китов мы пользовали только серебро... все остальное выбрасывали... а 100 нг Вы можете и на кумасях увидеть легко Сообщение было отредактировано Oleg Klychnikov - 22.09.2005 12:26 |
Oleg Klychnikov Постоянный участник Moscow/Amsterdam->Leiden |
ИМХО быстрее и воспроизводимей... поищите здесь он уже обсуждался де-факто, однин из лучших методов, совместимых с МС - это метод Шевченко и Со Shevchenko, A et al. Anal Chem. 1996 68(5): 850-8 Сообщение было отредактировано Oleg Klychnikov - 22.09.2005 12:46 |
Comrad600 Участник |
Мы перешли на Colloidaл blue с очень очень долгой окраской на шейкере (около 4-5 суток.) Дефиниция нас устроила (и чувствительность) (это 2д гели) |
imers Участник Москва |
Чтобы избежать быстрого почернения геля при проявке - используйте _очень_холодный_ раствор соды (можно даже с кусочками льда), в крайнем случае - свежевынутый с +4. Да, а тиосульфат в р-р соды Вы разве не добавляете? |
Derro Постоянный участник |
|
Masha11 |
|
Mac-1 Постоянный участник оттуда |
Попробуйте увеличить все сроки как минимум в 2 раза. Сенсибилизацию - не менее 1 часа, нитрат серебра - 30-40 мин (на холоду в холодном Ag). Помывки после сенсибилизации по 10 мин, причем воды - не менее 200 мл, и не 3 раза, а раз 5-6 итд А с серебром, действительно плохо, самый больший "грех" у него - нелинейность окраски (нет прямой зависмости между количеством белка и интенсивностью окраски). из коллоидного Кумасси самый лучший, что я пробовал - Пирсовский Code Blue, он намного чувствительнее, чем, например, коллоидный Кумасси БайоРада, особенно с последующей выдержкой в уксусе. |
nigoal123 IP-штамп: fr4iy3.kHUw02 гость |
must be after reading fifty exam papers. |
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |