Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
pApA2017 |
Имеется известная аминокислотная последовательность белка. Как, зная эту последовательность подобрать последовательность для ДНК-зонда, который будет сшиваться далее с биотином? Чем определяется длина зонда, как определяется оптимальная последовательность(есть ли алгоритм оптимального выбора) триплетов (одна аминокислота может кодироваться несколькими триплетами - то для последовательности из 10 аминокислот уже 3^10 вариантов* - какой вариант предпочесть? * - если в среднем аминокислота кодируется тремя кодонами)? Мануал, протоколы, статьи приветствуются. Спасибо, коллеги. |
ksm Постоянный участник |
|
pApA2017 |
Есть аминокислотная последовательность. Нужно химически синтезировать ДНК-зонд, чтобы найти искомый маркер в библиотеке. Чтобы синтезировать олигонуклеотид, нужно знать последовательность оснований. Как эту последовательность определить? Или таким путем не идут? |
R-J-Dio Постоянный участник |
почитайте тут естесственно, что ген-специфические праймеры будут вырожденнные, и не один, а 2-3 nested. Вырожденность выше 16 довольно бессмысленно делать, лучше разбить на 2 праймера и тп. Много нюансов. Неофиту не советовал бы самостоятельно ввязываться в эту авантюру без глаза профи звоните, консультируйтесь, заказывайте услуги.
|
MMM Постоянный участник |
Это ключевой вопрос, без ответа на который, не возможно ответить на все следующие вопросы. И второй вопрос: Вам зонд для чего? В какого рода экспериментах вы его хотите использовать? Этот вопрос не так важен как первый, но может облегчить и улучшить ответы на остальные вопросы. |
pApA2017 |
Маленький вопрос в дополнение к тому, который был. Допустим, aa-последовательность FLIMVSAAKXFPTAYHQNKDECWLLRGXF* (взята наобум, поэтому совпадения с чем-то в бласте и др базах абсолютно не умышленно) Для E.Coli получим: UUYYUNAUHAUGGUNWSNGCNGCNAARUUYCCNACNGCNUAYCAYCARAAYAARGAYGARUGYUGGYUNYUNMNGGGNUUYURR R=A,G K=G,T H=A,C,T D=A,G,T Y=C,T S=C,G B=C,G,T N=A,G,C,T M=A,C W=A,T V=A,C,G Визуально видим последовательность с 10 нуклеотида: AUGGU Возьмем влево от нее еще 4 нуклеотида: NAUHAUGGU Таким образом получим 3*4=12 вариантов для олигонуклеотида длиной 9 п.н. Такой же метод есть? Неужели настолько метод неудобный, чтобы его не заюзать - он же очевиден. (понятно, что не каждая последовательность будет иметь такую удачную длину, но все же) Можно взять еще пару нуклеотидов влево: YUNAUHAUGGU - получим длину 11 и 12*2=24 вариантов олигонуклеотидов. Вполне нормальный компромис. Для поиска ДНК-маркера. Как такой метод называется? Или такой вариант праймера с 40-го нуклеотида: UAYCAYCARAA длина 11, вариантов 2*2*2=8. Сообщение было отредактировано pApA2017 - 03.12.2017 22:14 |
pApA2017 |
(MMM @ 03.12.2017 22:13) Аминокислотная последовательность белка какого организма? Это ключевой вопрос, без ответа на который, не возможно ответить на все следующие вопросы. И второй вопрос: Вам зонд для чего? В какого рода экспериментах вы его хотите использовать? Этот вопрос не так важен как первый, но может облегчить и улучшить ответы на остальные вопросы. 1. M. musculus 2. Зонд для вытаскивания ДНК с целевым геном. Для дальнейшей амплификации гена, сиквенса его и введения в плазмиду pUC для синтеза целевого белка в E.Coli. |
R-J-Dio Постоянный участник |
Вам надо структуру праймера получить не мытьем - так катаньем? Прям тут, после пары-тройки дней канючания в беседе? И дальше что? Вам ген надо получить- тогда праймер Вас не спасет. Способ решить проблему я указал, и кроме Еврогена, Вам никто не поможет. Бог- возможно, но ни герой и не царь- точно. Можете, конечно потренироваться сами, оно полезно Сообщение было отредактировано R-J-Dio - 03.12.2017 22:03 |
ksm Постоянный участник |
|
pApA2017 |
(ksm @ 03.12.2017 23:23) метод назвается blastp и blastx. а вам действительно лучше перестать лезть, туда, где вы не в состоянии изучить даже базовые понятия blastp и blastx сравнивает с имеющейся базой данных аминокислотных последовательностей. А здесь задача иная. Здесь - по имеющемуся сиквенсу белка и созданной библиотеке ДНК создать ДНК-зонд, т.е. подобрать правильный праймер, и пришить к нему биотин. Чтобы вытащить последовательность ДНК из библиотеки. Суть- скрининг нужного маркера по известной аминокислотной последовательности. |
ksm Постоянный участник |
|
MMM Постоянный участник |
Откуда ДНК вытаскивать будем? |
R-J-Dio Постоянный участник |
|
pApA2017 |
(MMM @ 03.12.2017 23:52) --2. Зонд для вытаскивания ДНК с целевым геном. Для дальнейшей амплификации гена, сиквенса его и введения в плазмиду pUC для синтеза целевого белка в E.Coli. Откуда ДНК вытаскивать будем? Сделана библиотека с помощью E.Coli и pUC и нарезанной хромосомной ДНК. Цель найти колонию, в которой сидит плазмида с нужной последовательностью. ДНК будет вытаскиваться, соответственно, из плазмиды. |
MMM Постоянный участник |
Цель найти колонию, в которой сидит плазмида с нужной последовательностью. ДНК будет вытаскиваться, соответственно, из плазмиды. Тогда, извините, нуклеотидная последовательность зонда должна быть мышинная. Ибо искать вы будете мышинную последовательность, ибо мышинную последовательность вы клонировали в библиотеку. И последовательность наверняка доступна в генбанке, ибо геном мышки прочитан неоднократно, а экспрессируемые последовательности белковых генов вдоль и поперек. Сообщение было отредактировано MMM - 03.12.2017 23:09 |
pApA2017 |
(MMM @ 04.12.2017 00:08) --Сделана библиотека с помощью E.Coli и pUC и нарезанной хромосомной ДНК. Цель найти колонию, в которой сидит плазмида с нужной последовательностью. ДНК будет вытаскиваться, соответственно, из плазмиды. Тогда, извините, нуклеотидная последовательность зонда должна быть мышинная. Ибо искать вы будете мышинную последовательность, ибо мышинную последовательность вы клонировали в библиотеку. И последовательность наверняка доступна в генбанке, ибо геном мышки прочитан неоднократно, а экспрессируемые последовательности белковых генов вдоль и поперек. Мышиную последовательность нужно будет определять - с этим понятно. А выбор праймера как осуществлять? По такому алгоритму как я написал? (Допустим нету последовательности в базе, ну пусть организм другой - нету в базе - сама суть сейчас интересна, как поступают в таких случаях) Или есть какие-то правила для определения последовательности и количества праймеров? P.S. - Раз уж была затронута тема последовательности, то как определяются кодоны для нового не исследованного организма? Есть сборник протоколов для решения такой задачи? Сообщение было отредактировано pApA2017 - 04.12.2017 00:12 |
MMM Постоянный участник |
Во-первых если организм эукариотический, то в этом случае ищут не ДНК, а РНК. Ибо гены эукариот могут содержать интроны длинной до сотен килобаз. Во-вторых используют так называемый RACE-PCR для последовательного прочтния всей нуклеотидной последовательности мРНК. Что касается специфического праймера, получаемого для этой самой RACE PCR на основе найденной АК последовательности белка, то просто синтезируют вырожденный праймер . Т.Е. на местах многовариантных кодонов в вариабельные позиции при синтезе олигонуклеотида, добавляют смесь из всех тех нуклеотидов, которые соответствуют коду данной АК. Когда же амплифицированные фрагменты отсеквенируют, то тогда уже узнают и точную нуклеотидную последовательность.
|
pApA2017 |
(MMM @ 04.12.2017 01:33) Т.Е. на местах многовариантных кодонов в вариабельные позиции при синтезе олигонуклеотида, добавляют смесь из всех тех нуклеотидов, которые соответствуют коду данной АК. Т.е., правильно ли понимаю. Если АК последовательность белка E.Coli: FLIMVSAAKXFPTAYHQNKDECWLLRGXF* То РНК последовательность такая: UUYYUNAUHAUGGUNWSNGCNGCNAARUUYCCNACNGCNUAYCAYCARAAYAARGAYGARUGYUGGYUNYUNMNGGGNUUYURR R=A,G K=G,T H=A,C,T D=A,G,T Y=C,T S=C,G B=C,G,T N=A,G,C,T M=A,C W=A,T V=A,C,G Праймер берется по личному предпочтению? Допустим, для праймера берем последовательность с 40-го нуклеотида: UAYCAYCARAA длина 11, вариантов 8. И синтезируем 8 праймеров: TAСCACCAAAA TAСCACCAGAA TAСCATCAAAA TAСCATCAGAA TATCACCAAAA TATCACCAGAA TATCATCAAAA TATCATCAGAA ? |
MMM Постоянный участник |
Как вы думаете? Есть разница между вырожденным праймером и набором из множества праймеров? Сообщение было отредактировано MMM - 04.12.2017 07:11 |
R-J-Dio Постоянный участник |
|
nigoal123 IP-штамп: fr/1ZkUsuBQOE гость |
and technical language to help |
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |