Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Химический синтез ДНК-зонда.
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! pApA2017




 прочитанное сообщение 03.12.2017 18:00     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Задача следующая.
Имеется известная аминокислотная последовательность белка.
Как, зная эту последовательность подобрать последовательность для ДНК-зонда, который будет сшиваться далее с биотином?
Чем определяется длина зонда, как определяется оптимальная последовательность(есть ли алгоритм оптимального выбора) триплетов (одна аминокислота может кодироваться несколькими триплетами - то для последовательности из 10 аминокислот уже 3^10 вариантов* - какой вариант предпочесть? * - если в среднем аминокислота кодируется тремя кодонами)?

Мануал, протоколы, статьи приветствуются.
Спасибо, коллеги.
Участник оффлайн! ksm
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 03.12.2017 18:42     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

в вашей формулировке задача не решаема.
Участник оффлайн! pApA2017




 прочитанное сообщение 03.12.2017 18:56     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

Ок. Как можно переформулировать?
Есть аминокислотная последовательность. Нужно химически синтезировать ДНК-зонд, чтобы найти искомый маркер в библиотеке. Чтобы синтезировать олигонуклеотид, нужно знать последовательность оснований. Как эту последовательность определить? Или таким путем не идут?
Участник оффлайн! R-J-Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 03.12.2017 20:13     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

так гены никто не ищет, надо делать RACE
почитайте тут
http://evrogen.ru/technologies/step-out-race.shtml
естесственно, что ген-специфические праймеры будут вырожденнные, и не один, а 2-3 nested. Вырожденность выше 16 довольно бессмысленно делать, лучше разбить на 2 праймера и тп. Много нюансов. Неофиту не советовал бы самостоятельно ввязываться в эту авантюру без глаза профи

звоните, консультируйтесь, заказывайте услуги.

Всего благодарностей: 2Поблагодарили (2): pApA2017, kblag
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 03.12.2017 21:13     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

Аминокислотная последовательность белка какого организма?

Это ключевой вопрос, без ответа на который, не возможно ответить на все следующие вопросы.

И второй вопрос: Вам зонд для чего? В какого рода экспериментах вы его хотите использовать?

Этот вопрос не так важен как первый, но может облегчить и улучшить ответы на остальные вопросы.
Участник оффлайн! pApA2017




 прочитанное сообщение 03.12.2017 21:38     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

Всем спасибо.

Маленький вопрос в дополнение к тому, который был.

Допустим, aa-последовательность FLIMVSAAKXFPTAYHQNKDECWLLRGXF* (взята наобум, поэтому совпадения с чем-то в бласте и др базах абсолютно не умышленно)
Для E.Coli получим:

UUYYUNAUHAUGGUNWSNGCNGCNAARUUYCCNACNGCNUAYCAYCARAAYAARGAYGARUGYUGGYUNYUNMNGGGNUUYURR

R=A,G K=G,T H=A,C,T D=A,G,T
Y=C,T S=C,G B=C,G,T N=A,G,C,T
M=A,C W=A,T V=A,C,G

Визуально видим последовательность с 10 нуклеотида: AUGGU

Возьмем влево от нее еще 4 нуклеотида:
NAUHAUGGU
Таким образом получим 3*4=12 вариантов для олигонуклеотида длиной 9 п.н.

Такой же метод есть? Неужели настолько метод неудобный, чтобы его не заюзать - он же очевиден. (понятно, что не каждая последовательность будет иметь такую удачную длину, но все же)

Можно взять еще пару нуклеотидов влево:
YUNAUHAUGGU - получим длину 11 и 12*2=24 вариантов олигонуклеотидов. Вполне нормальный компромис. Для поиска ДНК-маркера.
Как такой метод называется?


Или такой вариант праймера с 40-го нуклеотида: UAYCAYCARAA
длина 11, вариантов 2*2*2=8.

Сообщение было отредактировано pApA2017 - 03.12.2017 22:14
Участник оффлайн! pApA2017




 прочитанное сообщение 03.12.2017 21:48     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

(MMM @ 03.12.2017 22:13)
Ссылка на исходное сообщение  Аминокислотная последовательность белка какого организма?

Это ключевой вопрос, без ответа на который, не возможно ответить на все следующие вопросы.

И второй вопрос: Вам зонд для чего? В какого рода экспериментах вы его хотите использовать?

Этот вопрос не так важен как первый, но может облегчить и улучшить ответы на остальные вопросы.

1. M. musculus
2. Зонд для вытаскивания ДНК с целевым геном. Для дальнейшей амплификации гена, сиквенса его и введения в плазмиду pUC для синтеза целевого белка в E.Coli.
Участник оффлайн! R-J-Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 03.12.2017 21:58     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

"Как такой метод называется?" Маразм- так он называется.И полное отсутствие понимания базовых вещей, не говоря уж о деталях
Вам надо структуру праймера получить не мытьем - так катаньем? Прям тут, после пары-тройки дней канючания в беседе? И дальше что? Вам ген надо получить- тогда праймер Вас не спасет. Способ решить проблему я указал, и кроме Еврогена, Вам никто не поможет. Бог- возможно, но ни герой и не царь- точно. Можете, конечно потренироваться сами, оно полезно

Сообщение было отредактировано R-J-Dio - 03.12.2017 22:03
Участник оффлайн! ksm
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 03.12.2017 22:23     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

метод назвается blastp и blastx. а вам действительно лучше перестать лезть, туда, где вы не в состоянии изучить даже базовые понятия
Участник оффлайн! pApA2017




 прочитанное сообщение 03.12.2017 22:37     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

(ksm @ 03.12.2017 23:23)
Ссылка на исходное сообщение  метод назвается blastp и blastx. а вам действительно лучше перестать лезть, туда, где вы не в состоянии изучить даже базовые понятия

blastp и blastx сравнивает с имеющейся базой данных аминокислотных последовательностей.
А здесь задача иная. Здесь - по имеющемуся сиквенсу белка и созданной библиотеке ДНК создать ДНК-зонд, т.е. подобрать правильный праймер, и пришить к нему биотин. Чтобы вытащить последовательность ДНК из библиотеки. Суть- скрининг нужного маркера по известной аминокислотной последовательности.
Участник оффлайн! ksm
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 03.12.2017 22:40     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

ну п*здец просто какой-то
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 03.12.2017 22:52     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

--2. Зонд для вытаскивания ДНК с целевым геном. Для дальнейшей амплификации гена, сиквенса его и введения в плазмиду pUC для синтеза целевого белка в E.Coli.
Откуда ДНК вытаскивать будем?
Участник оффлайн! R-J-Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 03.12.2017 23:01     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

как это вытащить ген? Для амплификации? А как амплифицировать будем? Такими подходами уж лет 20 как никто не работает, ребятушки!
Участник оффлайн! pApA2017




 прочитанное сообщение 03.12.2017 23:02     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #14 множественное цитирование

(MMM @ 03.12.2017 23:52)
Ссылка на исходное сообщение  --2. Зонд для вытаскивания ДНК с целевым геном. Для дальнейшей амплификации гена, сиквенса его и введения в плазмиду pUC для синтеза целевого белка в E.Coli.
Откуда ДНК вытаскивать будем?

Сделана библиотека с помощью E.Coli и pUC и нарезанной хромосомной ДНК.
Цель найти колонию, в которой сидит плазмида с нужной последовательностью. ДНК будет вытаскиваться, соответственно, из плазмиды.
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 03.12.2017 23:08     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #15 множественное цитирование

--Сделана библиотека с помощью E.Coli и pUC и нарезанной хромосомной ДНК.
Цель найти колонию, в которой сидит плазмида с нужной последовательностью. ДНК будет вытаскиваться, соответственно, из плазмиды.

Тогда, извините, нуклеотидная последовательность зонда должна быть мышинная.
Ибо искать вы будете мышинную последовательность, ибо мышинную последовательность вы клонировали в библиотеку. И последовательность наверняка доступна в генбанке, ибо геном мышки прочитан неоднократно, а экспрессируемые последовательности белковых генов вдоль и поперек.

Сообщение было отредактировано MMM - 03.12.2017 23:09
Участник оффлайн! pApA2017




 прочитанное сообщение 03.12.2017 23:36     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #16 множественное цитирование

(MMM @ 04.12.2017 00:08)
Ссылка на исходное сообщение  --Сделана библиотека с помощью E.Coli и pUC и нарезанной хромосомной ДНК.
Цель найти колонию, в которой сидит плазмида с нужной последовательностью. ДНК будет вытаскиваться, соответственно, из плазмиды.

Тогда, извините, нуклеотидная последовательность зонда должна быть мышинная.
Ибо искать вы будете мышинную последовательность, ибо мышинную последовательность вы клонировали в библиотеку. И последовательность наверняка доступна в генбанке, ибо геном мышки прочитан неоднократно, а экспрессируемые последовательности белковых генов вдоль и поперек.

Мышиную последовательность нужно будет определять - с этим понятно.
А выбор праймера как осуществлять? По такому алгоритму как я написал? (Допустим нету последовательности в базе, ну пусть организм другой - нету в базе - сама суть сейчас интересна, как поступают в таких случаях)
Или есть какие-то правила для определения последовательности и количества праймеров?

P.S. - Раз уж была затронута тема последовательности, то как определяются кодоны для нового не исследованного организма? Есть сборник протоколов для решения такой задачи?

Сообщение было отредактировано pApA2017 - 04.12.2017 00:12
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 04.12.2017 00:33     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #17 множественное цитирование

Если нет последовательности в генбанке это уже другой(я бы сказал совсем другой) вопрос.

Во-первых если организм эукариотический, то в этом случае ищут не ДНК, а РНК. Ибо гены эукариот могут содержать интроны длинной до сотен килобаз.

Во-вторых используют так называемый RACE-PCR для последовательного прочтния всей нуклеотидной последовательности мРНК.
https://en.wikipedia.org/wiki/Rapid_amplifi...on_of_cDNA_ends

Что касается специфического праймера, получаемого для этой самой RACE PCR на основе найденной АК последовательности белка, то просто синтезируют вырожденный праймер . Т.Е. на местах многовариантных кодонов в вариабельные позиции при синтезе олигонуклеотида, добавляют смесь из всех тех нуклеотидов, которые соответствуют коду данной АК. Когда же амплифицированные фрагменты отсеквенируют, то тогда уже узнают и точную нуклеотидную последовательность.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): pApA2017
Участник оффлайн! pApA2017




 прочитанное сообщение 04.12.2017 01:10     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #18 множественное цитирование

(MMM @ 04.12.2017 01:33)
Т.Е. на местах многовариантных кодонов  в вариабельные позиции при синтезе олигонуклеотида, добавляют смесь из всех тех нуклеотидов, которые соответствуют коду данной АК.


Т.е., правильно ли понимаю.

Если АК последовательность белка E.Coli: FLIMVSAAKXFPTAYHQNKDECWLLRGXF*

То РНК последовательность такая:
UUYYUNAUHAUGGUNWSNGCNGCNAARUUYCCNACNGCNUAYCAYCARAAYAARGAYGARUGYUGGYUNYUNMNGGGNUUYURR

R=A,G K=G,T H=A,C,T D=A,G,T
Y=C,T S=C,G B=C,G,T N=A,G,C,T
M=A,C W=A,T V=A,C,G


Праймер берется по личному предпочтению?
Допустим, для праймера берем последовательность с 40-го нуклеотида: UAYCAYCARAA
длина 11, вариантов 8.

И синтезируем 8 праймеров:

TAСCACCAAAA
TAСCACCAGAA
TAСCATCAAAA
TAСCATCAGAA
TATCACCAAAA
TATCACCAGAA
TATCATCAAAA
TATCATCAGAA

?
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 04.12.2017 07:08     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #19 множественное цитирование

Не-а.
Как вы думаете? Есть разница между вырожденным праймером и набором из множества праймеров?

Сообщение было отредактировано MMM - 04.12.2017 07:11
Участник оффлайн! R-J-Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 04.12.2017 11:51     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #20 множественное цитирование

вы температуру гибридизации подсчитайте для этих голимых коротышек, и что выйдет при таком вот скрининге колоний. градусов 30. Для того, кто это проделывал хоть раз в жизни- таких, вероятно, не сыскать уже- так вот, для них очевидна абсурдность постановки задачи. Вообще, гибридизовать на вырожденных олигах- прямой путь к false-positives,утрахаетесь разбираться в сигналах, тем более на люминисценции
Участник оффлайн! watchesbiz
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  20.11.2021 18:20     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #21 множественное цитирование

https://wanelo.co/replicarolexwatches
https://musescore.com/fakerolexwatches
https://www.racked.com/users/Replicarolexwatches
https://sketchfab.com/Rolexrelicawatches
http://www.video-bookmark.com/bookmark/433...eplica-watches/
https://www.slideserve.com/ReplicawatchesUK...pt-presentation
https://www.theverge.com/users/Replicarolexwatches
https://www.yumpu.com/en/document/read/6532...lica-watches-uk
https://online.flippingbook.com/view/152275247/
https://www.instapaper.com/p/8767342
https://www.bigblueview.com/users/Replicarolexwatches
https://weheartit.com/watcheshutuk
https://sites.google.com/view/replicarolexwatches24/home
https://www.indiehackers.com/post/hints-on-...atch-113aef73a9
http://replicawatchesuk.esportsify.com/for...ica-rolex-watch
nigoal123
IP-штамп: fr/1ZkUsuBQOE
гость



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  09.12.2021 11:39     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #22 множественное цитирование

The language should be แทงบอล active rather than passive สล็อต123 we carried out an analysis nigoal123 rather than 123game an analysis was carried out คาสิโนออนไลน์ It’s also important to use relevant keywords

and technical language to help หวย potential readers find your paper. เว็บ 123 These are the words or phrases เว็บ 123 a researcher might use when แทงบอลออนไลน์ searching for a paper on this topic. สล็อต123 You can find out more in our

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 30.03.24 03:05
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft