Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Как валидировать очистку от ДНК рекомбинантного белка -- Удалить ДНК и подтвердить чистоту --
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! KCN
Постоянный участник
Київ. Україна понад усе!



 прочитанное сообщение 09.07.2018 19:22     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Добрый день всем!
Стоит задаяа - очистить рекомбинантный белок с His-tag от урезанных форм и агрегатов на силикогельевой колонке для HPLC с фенильной прививкой в градиенте 2M (NH3)2SO4, подкисленный 0.1% трифторуксусной кислотой / бидистилированная H2O . Белок и его урезанные формы и агрегаты предварительно получены солюбилизацией телец включения и очисткой на Ni-NTA агарозе (элюция имидазолом). Эксклюзивную хроматографию использовать нельзя, так как образца очень мало - он используется под иммунизацию мышей для гибридом. Образец находится в буфере с сахарозой (выпадает в осадок без сахарозы или глицерина при замораживании). Очищать получается, но в системе присутствует ДНК. ДНК фрагментировали ультразвуком, затем обрабатывали ДНК-азой. Но что-то осталось. Фенилка имеет слабый положительный заряд, снять ДНК с нее получалось в солевом буфере, блокирующем отрицательный заряд фосфатов, с градиентом. Колонка не убилась так как использовал предколонку. По спектру на 254 нм было ясно видно что идет ДНК. (Прибор Agilent 1100).
Что лучше делать:
1. Обработать ультразвуком, затем ДНКазой.
2. Осадить полиэтиленимином
3. Осадить + заряженным хроматографическим сорбентом (Q-сефароза, DEAE)
Пробовал методы 1 и 3. ДНКаза работет не полностью, возможно надо диализировать в буфер, в котором она работет лучше. Один ультразвук не вариант - он только фрагментирует ДНК, а не удаляет. при выполнении метода 3 белок связывется с сорбентом сильнее чем ДНК. Методом 2 не решил воспользоваться так как остаток полиэтиленимина может намертво сесть на фенилку.
4. Может как-то использовать центрипреп?
Как валидировать очистку?
Пробовал при помощи спектрофотометра как 254 нм так и сканировать спектр 200 - 300 нм. Но что-то выглядит неубедительно. Кстати, взаимодействуя с белком ДНК меняет спектр поглощения. Но это не главное.
Буду благодарен за любую помощь.

Сообщение было отредактировано KCN - 09.07.2018 19:23
Участник оффлайн! Panaev
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 10.07.2018 13:54     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

Не очень понял вопрос.
Валидируют обычно уже разработанный процесс, а вы не знаете, как от ДНК очиститься. Да еще и процесс далек даже от экспериментального уровня производства. Что там валидировать?
Вам таки разработать или валидировать?
Участник оффлайн! KCN
Постоянный участник
Київ. Україна понад усе!



 прочитанное сообщение 10.07.2018 15:25     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

И то и другое. А валидируют при помощи PCR, где то так: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28426392

Так же это изложено в USP, BP, EP.

Есть порог чувствительности метода, но даже если ПЦР не обнаруживает копий вектора, они все равно там присутствуют в подпороговом количистве. Более того, при промышленной очистке от ДНК, целые молекулы ДНК попадают в конечную фракцию белка. Поэтому, они будут медленно, но уверенно забивать колонку, особенно если колонка минипреапаративная, годная для аналитики. Логично, что без предколонки работать нельзя.
Или надо подбирать сорбент и буфер, чтобы высадить ДНК на самонабивной колонке на FPLC.

Сообщение было отредактировано KCN - 11.07.2018 05:54
Участник оффлайн! vb
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 10.07.2018 19:55     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

Боже ж ты мой....
ну допустим, аббревиатуру rt-pcr даже в урюпинске применяют в смысле пцр с обратной транскрибцией. Обычно пишут qPCR.
ну допустим, вам еще и сам медод контроля нужно будет валидировать. А валидировать пцр доя контроля остаточной днк нетривиальная задача. Так как в отличие от ваших представлений у пцр чувствительность сильно выше критерия приемлемости. Сколько у вас там критерий приемлемости? 10 нг/доза или 5?
ну допустим, есть и другие suitable methods.
ну допустим, не надо так гордо размахивать юэспи и бипи. В родной гф 13 это тоже есть.
Ну и вершина - промышленная колонка минипрепаративная, годная для аналитики! Я это даже запишу где-нибудь. Вы точно понимаете, чем занимаетесь?
Участник оффлайн! KCN
Постоянный участник
Київ. Україна понад усе!



 прочитанное сообщение 11.07.2018 06:02     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

Так и пугайте в Урюпинске своей PCR пьяных медведей, в обнимку с ГФ13. У нас в Украине ваша ГФ13 является просто макулатурой, пригодной для того, чтобы заворачивать в нее сало. Так как не гармонизирована с EP и BP, частично с USP, в то время как ДФУ - большей частью гармонизирована, за исключением N - статей (Nationality).
Что касается минипрепаративной колонки - то вы когда-либо слышали, что такое масштабирование? Или низкие температуры тундры российской необъятной паталогически влияют на уши?

Запишите себе, и обязательно добавте к тому, что для очистки белка для иммунизации животных ПРОМЫШЛЕННАЯ колонка НЕ требуется, поскольку в промышленных масштабах животных НЕ иммунизируют. Из них получают гибридомы, из которых потом чистят антитела, вот там уже и используют промышленные колонки. Для очистки белка для иммунизации нужны какие-то микрограммы, но желательно, очень чистого белка, без агрегатов, урезанных форм и белков клеток хозяина.

Более того, в данной ситуации важна очистка белка от ДНК чтобы не убить колонку, а не из-за потенциально онкогенных эффектов на организм - мышек не жалко, у них и так иммунные клетки нужной специфичности появляются, даже если в белке будет ДНК.

"Вы точно понимаете, чем занимаетесь?"
- более чем вы себе представляете, в условиях весьма скудных ресурсов и оборудования.

Сообщение было отредактировано KCN - 11.07.2018 14:59
Участник оффлайн! KCN
Постоянный участник
Київ. Україна понад усе!



 прочитанное сообщение 11.07.2018 08:45     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

Кстати, аббревиатура RT-PCR может обозначать два разных метода Real Time PCR и Reverse transcription PCR. Использовать обозначение qPCR (quantitative PCR) более корректно. Я имел ввиду Real Time PCR.
Reverse transcription PCR может выполняться и в обычном циклере, без детекции, с последующим разделением продуктов в агарозном геле. Это полуколичественный метод в такой постновке. Так что не всегда reverse transcription PCR = qPCR.

Сообщение было отредактировано KCN - 11.07.2018 08:53
Участник оффлайн! KCN
Постоянный участник
Київ. Україна понад усе!



 прочитанное сообщение 11.07.2018 10:02     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

Кстати, микрограммы белка может даже лучше чистить на фенилке 250x4.7 мм, самой "толстой" из аналитических, так как на минипрепаративной он может выйти размытым - ведь его очень мало. Если бы белка было больше - я бы прогнал его через FPLC, используя гельфильтрационный сорбент.

Я уже чистил этот белок на HPLC, условия подобраны, но пришлось промывать предколнку отдельно , чтобы снять ДНК буфером с солью, экранирующей негативные заряды фосфатов.

ДНК приводит к существенному возрастанию давления , а когда сходит с сорбента, дает пик на 254 нм. И это после ультразвука и ДНК-азы EN 0521 DNA-se I Fermentas. Но больше эту эквилибристику делать как-то неохота.

Сообщение было отредактировано KCN - 11.07.2018 10:03
Участник оффлайн! vb
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 11.07.2018 21:13     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

(KCN @ 11.07.2018 04:02)
Ссылка на исходное сообщение  Так и пугайте в Урюпинске своей PCR пьяных медведей, в обнимку с ГФ13. У нас в Украине ваша ГФ13 является просто макулатурой, пригодной для того, чтобы заворачивать в нее сало. Так как не гармонизирована с EP и BP, частично с USP, в то время как ДФУ - большей частью гармонизирована, за исключением N - статей (Nationality).
Что касается минипрепаративной колонки - то вы когда-либо слышали, что такое масштабирование?  Или низкие температуры тундры российской необъятной паталогически влияют на уши?

Запишите себе, и обязательно добавте к тому, что для очистки белка для иммунизации животных ПРОМЫШЛЕННАЯ колонка НЕ требуется, поскольку в промышленных масштабах животных НЕ иммунизируют. Из них получают гибридомы, из которых потом чистят антитела, вот там уже и используют промышленные колонки. Для очистки белка для иммунизации нужны какие-то микрограммы, но желательно, очень чистого белка, без агрегатов, урезанных форм и белков клеток хозяина.

Более того, в данной ситуации важна очистка белка от ДНК чтобы не убить колонку, а не из-за потенциально онкогенных эффектов на организм - мышек не жалко, у них и так  иммунные клетки нужной специфичности появляются, даже если в белке будет ДНК.

"Вы точно понимаете, чем занимаетесь?"
- более чем вы себе представляете, в условиях весьма скудных ресурсов и оборудования.

Продолжайте заворачивать сало.
про промышленную хроматографию на аналитической колонке не я написал.

Впрочем, по теме сабжа - зачем вам в вашей кустарщине валидация? Ну почистили микрограммы, ну вкололи для получения гибридом. Валидация-то тут причем? Или слово красивое? Забудьте. Подберите условия очистаи на анионообменнике и работайте себе с миром на своей украине.
Участник оффлайн! KCN
Постоянный участник
Київ. Україна понад усе!



 прочитанное сообщение 12.07.2018 07:57     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

Видимо, термин "валидация" и вас не оставляет равнодушным, так как действует как красная тряпка на быка ;-)

Что касается вашей ГФ13, до того как защитить диссертацию, я работал на фармкорпорации. И как ни странно, регистрировал в Украине субстанции - рекомбинантные белки in bulk, производимые одной небезизвестной фирмой из России, называть ее я не буду. Так как я был инженером-технологом в R&D, то моя часть была модуль 3 CTD, качество. Там была жуткая несходимость по всем параметрам с ведущими фармакопеями мира, не говорю уже о нашей ДФУ. Практически по всем испытаниям. Ваша ГФ является прямым потомком фармакопеи СССР, и она настолько уклонилась в своем развитии от мировых фармакопей, что начала создавать трудности для выхода ваших фармкомпаний на мировой рынок. Российское АНД не подошло. Пришлось писать свое АНД на контроль качества субстанции, уже согласно требованиям ЕР и ДФУ. Но вашу валидацию техпроцесса мы подтвердить не смогли. И валидировать аналитические методики - это тоже обязаность инженера технолога R&D, и геморрой с этим был еще тот. Тем не менее, российский продукт был качественный и испытания выдержал. Но это уже оффтопик.

Что касается ионообменников, то они связывают белок сильнее, чем ДНК. Уже проверил.
Спиртом высаждать тоже не вариант, но попробовать можно. Можно попробовать и высолить сульфатом аммония. Для "человеческого употребления" сульфат аммония в биотехнологии запрещен, по крайней мере у нас в Украине. Но мышкам колоть после него белок можно.

Но контролировать наличие ДНК все таки надо, чтобы не убить колонку. ПЦР и праймеров у меня нету, надо попробовать СФ. Есть какая-то формула, когда-то видел, в Скоупсе, в "Методах выделения белка", есть формула, подставляя значения поглощения на СФ на волнах 254 и 280 нм можно вычислить количество ДНК и степень связывания с белком. Надо найти и попробовать.
Участник оффлайн! KCN
Постоянный участник
Київ. Україна понад усе!



 прочитанное сообщение 12.07.2018 15:58     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

Лично мне уже и так понятно, что валидировать очистку согласно фармакопейным требованиям невозможно. Ввиду отсутствия ПЦР-аппарата и реактивов. Тему можно закрывать.
Участник оффлайн! KCN
Постоянный участник
Київ. Україна понад усе!



 прочитанное сообщение 18.07.2018 13:08     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

Кстати есть еще идея осадить интактную ДНК протаминами, например сальмином. А потом центрифугировать на максимальных g. Ионообменники я не пробую, так как рекомбинантный белок связывается с такими положительно заряженными сорбентами как Q-сефароза и DEAE.

Проверить , ушла ли ДНК из расствора рекомбинантного белка можно при помощи ПЦР на Т3-Т7 праймеры (или Т5 - там в зависимости от плазмиды, сиквенирующие праймеры) для плазмиды и праймерами на 16S рРНК гены - на геномную ДНК. Так пишут в литературе по поводу подтверждения удаления ДНК продуцента бактериального типа. Эти праймеры есть в продаже, уже готовые, поэтому к ним есть документация, что облегчает подтверждение качества.
Участник оффлайн! LMP
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 18.07.2018 17:36     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

(KCN @ 18.07.2018 11:08)
Ссылка на исходное сообщение   Эти праймеры есть в продаже, уже готовые, поэтому к ним есть документация, что облегчает подтверждение качества.
праймеры то да есть, а вот уровень загрязнения ДНК они вам покажут или вам не актуально?
Участник оффлайн! KCN
Постоянный участник
Київ. Україна понад усе!



 прочитанное сообщение 18.07.2018 22:30     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

(LMP @ 18.07.2018 18:36)
Ссылка на исходное сообщение  праймеры то да есть, а вот уровень загрязнения ДНК они вам покажут или вам не актуально?


Мне как раз и надо оценить количество геномной и векторной ДНК, которая загрязняет рекомбинантный белок. Загрязнение ДНК другими ДНК или РНК меня не интересует. Важен факт подтверждения избавления от ДНК при помощи УЗ и ДНК-азы. Я ж не ДНК чищу, а белок.
Участник оффлайн! KCN
Постоянный участник
Київ. Україна понад усе!



 прочитанное сообщение 18.07.2018 23:08     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #14 множественное цитирование

(LMP @ 18.07.2018 18:36)
Ссылка на исходное сообщение  праймеры то да есть, а вот уровень загрязнения ДНК они вам покажут или вам не актуально?


Ваше сообщение натолкнуло меня на следующую мысль. Что если использовать процедуру очистки ДНК при помощи фенольного метода?
Можно ее использовать для очистки белка. Только водную фазу с ДНК/РНК откинуть, а фенольную с белком собрать.
Далее в фенол добавить петролейный эфир и гексан для снижения поверхностного натяжения и температуры кипения смеси.
Отогнать огранику при температуре +35С, чтобы не коагулировать белок.
Осадок белка расстворить в PBS рН 7.4 или TRIS HCl.
Отобрать пробу на ПЦР как из расстворенного очищенного белка так и из откинутой фракции ДНК в водной фазе.
Если в рекомбинантном белке нет ДНК, его можно наносить на колонку.
umnik.gif

Сообщение было отредактировано KCN - 18.07.2018 23:19
Участник оффлайн! KCN
Постоянный участник
Київ. Україна понад усе!



 прочитанное сообщение 19.07.2018 07:35     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #15 множественное цитирование

По идее, после фенола с белком ничего плохого не случится, так как белок НЕ ренатурированный - он получен путем солюбилизации телец включений и очистки на Ni-NTA. Там хватает как урезанных форм так и внутримолекулярных и межмолекулярных агрегатов.

Для получения моноклонов на линейный эпитоп это не критично. Если надо детектировать пространственный эпитоп, например комплекс лиганд-рецептор , то лучше использовать поликлоны, полученные путем иммунизации мышей комплексом лиганд-рецептор. Это по нашим данным.
Участник оффлайн! KCN
Постоянный участник
Київ. Україна понад усе!



 прочитанное сообщение 19.07.2018 07:50     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #16 множественное цитирование

Солюбилизировать тельца включения лучше в 8М мочевине. А вот так делать нельзя: http://bd.patent.su/2347000-2347999/pat/se...ervlet20cb.html в моем случае.

Triton и SDS и другие детергенты, используемые для солюбилизации телец включения, садяться на силикогель с фенильной прививкой, модифицируя поверхность сорбента. Отмыть от ионных детергентов колонку тяжело.
https://www.chemass.si/ca_content/Cleaning_...-18_columns.pdf

Хотя 1% SDS в виде инъекции можно вводить в случае намертво севших на колонку белков. Но лучше их отмывать градиентом ddH2O/ Acetonitrile 100%. [ Reversed-Phase Column Cleaning: SDS is OK, Vydac Advances, Grace/Vydac (The Separations Group (Hesperia, California, Winter 1998).]
http://phx.phenomenex.com/lib/gu54810610.pdf
Участник оффлайн! KCN
Постоянный участник
Київ. Україна понад усе!



 прочитанное сообщение 19.07.2018 09:55     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #17 множественное цитирование

(KCN @ 19.07.2018 08:35)
Ссылка на исходное сообщение  По идее, после фенола с белком ничего плохого не случится, так как белок НЕ ренатурированный - он получен путем солюбилизации телец включений и очистки на Ni-NTA. Там хватает как урезанных форм так и внутримолекулярных и межмолекулярных агрегатов.

Для получения моноклонов на линейный эпитоп это не критично. Если надо детектировать пространственный эпитоп, например комплекс лиганд-рецептор , то лучше использовать поликлоны, полученные путем иммунизации мышей комплексом лиганд-рецептор. Это по нашим данным.



Собственно, с чего я начал огород городить, чтобы было понятно. Если иммунизировать животных смесью межмолекулярных и внутримолекулярных агрегатов, урезанных форм и нормального белка, получаются гибридомы, продуцирующие кросс-реактивные антитела. В итоге специфичность тестсистем на основе этих моноклонов серьезно падает, из-за перекрестных реакций с другими белками.
Участник оффлайн! vb
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 19.07.2018 20:36     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #18 множественное цитирование

(KCN @ 19.07.2018 07:55)
Ссылка на исходное сообщение  Собственно, с чего я начал огород городить, чтобы было понятно. Если иммунизировать животных смесью межмолекулярных и внутримолекулярных агрегатов, урезанных форм и нормального белка, получаются гибридомы, продуцирующие кросс-реактивные антитела. В итоге специфичность тестсистем на основе этих моноклонов серьезно падает, из-за перекрестных реакций с другими белками.

Ну это, если про селекцию клонов вам не рассказали в свое время.
Хотя, проблема вообще даже не в этом. Вся эта возня с днк - пустое.
Участник оффлайн! KCN
Постоянный участник
Київ. Україна понад усе!



 прочитанное сообщение 19.07.2018 21:27     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #19 множественное цитирование

Я приеду, попробую удалить ДНК фенольным методом и ДНК-азой, отдам на ПЦР, сравню результаты а потом отпишусь.
Участник оффлайн! KCN
Постоянный участник
Київ. Україна понад усе!



 прочитанное сообщение 19.07.2018 21:42     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #20 множественное цитирование

(vb @ 19.07.2018 21:36)
Ссылка на исходное сообщение  Ну это, если про селекцию клонов вам не рассказали в свое время.
Хотя, проблема вообще даже не в этом. Вся эта возня с днк - пустое.


Персональноя я гибридомы не веду. Это делают дэвочки shuffle.gif
Селекцию клонов я проводил на фаговом дисплее для scFv - одноцепочечных миниантител, фаг М13. Делал библиотеки, ставил пенинг, отбирал клоны, анализировал. Руководство прикрыло эту тему ввиду сложностей ренатурации scFv - выход составлял 9-15%. И это были далеко не первые белки, которые мы ренатурировали. С другими было лучше.

Сообщение было отредактировано KCN - 22.07.2018 11:42
Участник оффлайн! KCN
Постоянный участник
Київ. Україна понад усе!



 прочитанное сообщение 20.07.2018 14:25     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #21 множественное цитирование

Приехал. Решил опробовать фенольный метод. Вначале я решил выяснить, можно ли так работать с белком вообще без ДНК.
Для того чтобы не тратить рекомбинантный белок, потренировался на лизоциме из куринного яйца и на человеческом сывороточном альбумине.
Оба белка расстворил в буфере PBS pH 7.4, добавил фенольную фазу, размешал на vortex.
Собрал фенольную фазу, добавил гексан и петролейный эфир. Произвел отгонку.
Белок сформировал хлопьеорбразный осадок после отгонки органики.
Повторное расстворение в PBS произошло не полностью - белок плавал агрегатами,
хлопьями, появилась муть. Колоть такое в хроматограф - убить колонку.
В лучшем случае очитститься трипсином на ночь с последующим градиентом ddH2O / acetonitrile.
Такое поведение белка связано с тем, что формеруемый гидрофобными остатками кор белка разворачивается в огранических расстворителях и полностью денатурирует. При отгонке и переводе в водную фазу коровые гидрофобные аминоксилоты разных полипептидных цепей принадлежащих разным молекулам взаимодействуют между собой, вытесняя воду и образуют
межмолекулярные агрегаты, непригодные для хроматографирования и иммунизации животных.
Поэтому вопрос об анализе полноты удаления ДНК из такой системы отпал сам собой. Будем использовать УЗ и ДНК-азу.
Участник оффлайн! KCN
Постоянный участник
Київ. Україна понад усе!



 прочитанное сообщение 21.07.2018 17:33     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #22 множественное цитирование

Возможно ошибка в том, что белок после отгонки органики надо расстворять не в PBS а в 8М мочевине или гуанидине + бетамеркаптоетанол для восстановления дисульфидных связей. Как тельца включения. А потом переводить в PBS или другой буфер путем диализа с добавлением перекиси водорода для окисления дисульфидных связей (что-то типа ренатурации диализом, низкая концентрация белка будет мешать образованию межмолекулярных агрегатов).
Участник оффлайн! KCN
Постоянный участник
Київ. Україна понад усе!



 прочитанное сообщение 27.07.2018 09:07     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #23 множественное цитирование

Удалил ДНК при помощи ультразвука и обработки ДНК-азой EN 0521 DNA-se I Fermentas. Отправил пробы до УЗ, после УЗ, до DNA-зы и после DNA-зы на qPCR с сиквенс праймерами. После обработки DNA-se согласно методикам производителя, ДНК в пробе обнаружено не было. Благодарю за внимание, всем удачного дня!
Участник оффлайн! Добрыня Никитич




 прочитанное сообщение 05.08.2018 10:25     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #24 множественное цитирование

(KCN @ 09.07.2018 20:22)
Ссылка на исходное сообщение  Добрый день всем!
Стоит задаяа - очистить рекомбинантный белок с His-tag от урезанных форм и агрегатов на силикогельевой колонке для HPLC с фенильной прививкой в градиенте 2M (NH3)2SO4, подкисленный 0.1% трифторуксусной кислотой / бидистилированная H2O .  Белок и его урезанные формы и агрегаты предварительно получены солюбилизацией телец включения и очисткой на Ni-NTA агарозе (элюция имидазолом). Эксклюзивную хроматографию использовать нельзя, так как образца очень мало - он используется под иммунизацию мышей для гибридом. Образец находится в буфере с сахарозой (выпадает в осадок без сахарозы или глицерина при замораживании). Очищать получается, но в системе присутствует ДНК. ДНК фрагментировали ультразвуком, затем обрабатывали ДНК-азой. Но что-то осталось. Фенилка имеет слабый положительный заряд, снять ДНК с нее получалось в солевом буфере, блокирующем отрицательный заряд фосфатов, с градиентом. Колонка не убилась так как использовал предколонку. По спектру на 254 нм было ясно видно что идет ДНК. (Прибор Agilent 1100).
Что лучше делать:
1. Обработать ультразвуком, затем ДНКазой.
2. Осадить полиэтиленимином
3. Осадить + заряженным хроматографическим сорбентом (Q-сефароза, DEAE)
Пробовал методы 1 и 3. ДНКаза работет не полностью, возможно надо диализировать в буфер, в котором она работет лучше. Один ультразвук не вариант - он только фрагментирует ДНК, а не удаляет.  при выполнении метода 3 белок связывется с сорбентом сильнее чем ДНК. Методом 2 не решил воспользоваться так как остаток полиэтиленимина может намертво сесть на фенилку.
4. Может как-то использовать центрипреп?
Как валидировать очистку?
Пробовал при помощи спектрофотометра как 254 нм так и сканировать спектр 200 - 300 нм. Но что-то выглядит неубедительно. Кстати, взаимодействуя с белком ДНК меняет спектр поглощения. Но это не главное.
Буду благодарен за любую помощь.

Блин, ну HPLC используется для очистки низкомолекулярных веществ,
а для очистки белков используется FPLC
Вы точно понимаете что вы делаете?
Участник оффлайн! KCN
Постоянный участник
Київ. Україна понад усе!



 прочитанное сообщение 08.08.2018 11:47     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #25 множественное цитирование

FPLC чаще используется для белков, HPLC - для низкомолекулярных веществ. Но когда мне надо проанализировать пептиды или белки я так же использую HPLC. Например фибринопептиды А и В , методика по Henshen. Или к примеру b-beta-N-domen, alpha-C-region фибриногена. Это уже домены 14-12 кДа. Более того, белки можно выделить и отнести на масспектр. Для zorbax du pont instruments колонки с фенильной прививкой , оказалось возможным получать микрограммы очень чистых белков и пептидов из плазмы крови или из фибриногена после черновой очистки центрипрепом, FPLC , осаждением фибрина/фибриногена температурой 54-58C. Эти фракции можно не только анализировать на масспектре, но и колоть мышками для иммунизации. Так же неплохо почистился вышеуказанный рекомбинантный белок (54 кДа). Если важна чистота пептида или белка о примесей, отличающихся на пару аминокислот и дающих перекрестную реакцию на моноклонах - HPLC годный вариант, лучше чем FPLC. И если у вас этого белка очень мало - порядка микрограмм. В остальных случаях я использую FPLC.

Если колонка забивается белком, например остатками фибриногена, я обычно прокачиваю трипсином в соответствующем буфере, и оставляю в нем систему на ночь. Утром промывают и все работает. Больше всего мне нравится возможность различать белок на C18-C8-фенилке и других колонках этого типа при разнице в одну аминокислоту, даже незаряженную.
И связка HPLC-масспектр себя хорошо зарекомендовала. Для рекомбинантных пептидов и белков есть смысл ставить предколонку. Набивают ее при помощи FPLC packing chamber, если набить вручную высокое давление спрессует сорбент и будет пузырь с буфером. Пакующая камера позволяет не пускать сорбент в буфере через насос FPLC, а выдавливать его в колонку или предколонку как из шприца. Есть специальные аппараты для паковки колонок и предколонок, но они дороже чем пакующая камера и узкоспециализированны. В них нет особого смысла. Если предколонку забьет ДНК, ее можно отсоединить от колонки и промыть буфером с ДНКазой, оставив так же на ночь. Это я пока не пробовал.

Сообщение было отредактировано KCN - 11.10.2018 14:45
Участник оффлайн! KCN
Постоянный участник
Київ. Україна понад усе!



 прочитанное сообщение 11.10.2018 14:41     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #26 множественное цитирование

Что касается работы с белками, с молекулярными массами 1- 50 кДа и более, не только с пептидами, привожу ссылки на документы производителя Agilent 1100 , колонки Zorbax:

https://www.agilent.com/cs/library/brochure...-2103EN_150.pdf
http://www.proquinorte.com/es/productos/cr...scargas/bio.pdf
http://quimica.udea.edu.co/~carlopez/hplc/...log-2011-12.pdf

Хорошие колонки для работы: 9.4 мм и 21.2 мм в диаметре - это минипрепаративные и препаративные колнки, позволяют очистить от 15 до 50 мг материи. НО: на прибор Agilent 1100 производитель НЕ рекомендует ставить колонки "толще" 9.4 мм, т.е. только минипрепаративные.
Ну, мне достаточно. Притом для пептидов и белков рекомендуют С18, фенилку считают менее подходящим вариантом.

P.S.:
Протокол чистки трипсином, может кому понадобится: 180 минут со скоростью подачи трисового буфера рН 7.4 0.15 мл/мин, инъекция трипсина ( до 1 мкг/мл), 100 мкл, температура 36С, колонка 4.7x250 мм.
Чиститься отлично, после трипсина можно промыть градиентом буфер/30% изопропанол, со скоростью 0.3 мл/мин, так как изопропанол очень вязкий, вымывает остатки трипсина и пептиды.

Сообщение было отредактировано KCN - 11.10.2018 14:48
Участник оффлайн! KCN
Постоянный участник
Київ. Україна понад усе!



 прочитанное сообщение 11.10.2018 15:36     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #27 множественное цитирование

Выбрал две минипрепаративные колонки с С18, хочу попробовать еще и на них. Если куплю их и что получится - отпишусь.

Choose:
80Å for < 4 - 5 kD
300Å for > 4 - 5 kD

1. Protein Separations
Reversed-Phase Columns C18
StableBond (80Å) Reversed-Phase HPLC Columns
ZORBAX StableBond Columns (80Å) Ordering Information
Semi-Preparative
9.4x250 mm,5 mkm,
880975-202

2.Protein Separations
Reversed-Phase Columns C18
ZORBAX StableBond (300Å) Column Ordering Information
Semipreparative
9.4x250 mm, 5 mkm,
880995-202

http://www.proquinorte.com/es/productos/cr...scargas/bio.pdf

Притом для пептидов и белков производители рекомендуют С18, фенилку считают менее подходящим вариантом. И система буфер1/буфер2+ацетонитрил %, с вариациями с ТФУ. А не 2М (NH4)2SO4/ddH2O и фенилка.

Сообщение было отредактировано KCN - 11.10.2018 15:38

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Биофизика и матметоды в биологии · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 19.10.18 15:19
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft