Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
watchesbiz | Отправлен 23.11.2021 15:56 |
Serpent | Отправлен 14.11.2016 18:15 |
Не совсем понял - для чего использовать SYPRO Ruby? Вместо кумасей для придания заряда белкам? | |
Veshka | Отправлен 14.11.2016 17:19 |
(Serpent @ 04.11.2016 18:23) Спасибо всем за комменты. которой дальнейшие манипуляции проводить кажется бессмысленным. Вопрос классический - что я делаю не так? Мембрана, если это важно, нитроцеллюлозная. А фиг его знает. Методика BN муторная, с кучей всяких предостережений, мне когда-то сразу не понравилась. Возьмите SYPO Ruby. Очень просто и эффективно. |
|
Serpent | Отправлен 04.11.2016 20:23 |
Спасибо всем за комменты. Продолжение истории такое - попробовал впервые в жизни поставить BN-PAGE, получил какую-то фигню. По всем протоколам кол-во Coomassie G-250 в катодном буфере должно быть 0,02%. Однако, при такой концентрации сей буфер имеет насыщенный темно-синий цвет. Гель, соответственно, после фореза тоже был синий, и после мокрого переноса ожидаемо получилась равномерно синяя мембрана, с которой дальнейшие манипуляции проводить кажется бессмысленным. Вопрос классический - что я делаю не так? Мембрана, если это важно, нитроцеллюлозная. |
|
Veshka | Отправлен 29.10.2016 04:07 |
Если белок мембранный, то при условии формирования димера, второй компонент должен ассоциироваться с мембранной фракцией в присутствии рапамицина и не ассоциироваться - в отсутствии. | |
MMM | Отправлен 28.10.2016 13:51 |
Просто если вы возьмете низкую концентрацию лиганда в среде типа 10нм, то понятно, что в клетках больше 10нм вы не получите. Соответственно потом, когда вы будете делать лизат, вы еще все это разбавите и комплекс распадется сам собой. Поможет ли в этом случае увеличение концентрации в среде, гарантировать нельзя, до какой-то степени может помочь. Так же не очень понятно насколько на прочность комплекса повлияет электрофорез как меняется удельный заряд в комплексе относительно его компонентов? Но попробовать можно. Все ж довольно просто: берёте отовсюду убираете SDS, ничего не кипятите и пробу делаете мягким лизисом в гипотоническом буфере с 0,1-0,3% тритона в одном случае с добавлением лиганда в другом без и смотрите по двум антителам(или тагам, что там увас) окраску. | |
Flyamer | Отправлен 28.10.2016 04:00 |
Можно еще split TEV. |
|
Serpent | Отправлен 27.10.2016 23:45 |
В среде от 10 нМ до 1 мкМ, по мануалу. Я пробовал от 250 нм до 1 мкМ. | |
MMM | Отправлен 27.10.2016 23:38 |
А какая примерно концеентрация лиганда внутри клетки или хотябы в среде в условиях эксперимента? | |
ship | Отправлен 27.10.2016 22:37 |
мне кажется вам FRET подойдет. без лиганда по нулям, а налили индуцирующий лиганд - белки провзаимодейтвовали, и, опа, перенос энергии. и главное это еще и количественно можно померять, даже дозозависимо. только надо конструкции под ФРЕТ переделывать. с форезом и вестреном- мне кажется вам будет тяжело одновременно и солюбилизовать мембранный белок, и при этом еще и видеть комплекс. |
|
Посмотреть тему (откроется в новом окне) | |