Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Нургуль551526 |
вквик чэйндже там просто ДНК метилируют и все. |
ship Постоянный участник Moscow |
Полимераза - любая высокоточная типа Pfx etc. DpnI - просто фермент. Компетешки - хоум-мейд. Полная эмуляция квикченйдж. Работает на ура. У НЕБ киназа нужна для того, что по их протоколу лигирование идет до трансформации в еколи, ну и соответственно концы надо фосфорилировать. По квикчейндж лигирование идет в клетках еколи тк после ПЦР образуются кольцевые плазмиды с никами. И дизайн праймеров существенно отличает, по квикчейндж праймеры комплементарые, а по Q5 протоколу - нет. Поэтому и надо лигировать перед трансформацией.
|
R-J-Dio Постоянный участник |
|
ship Постоянный участник Moscow |
(R-J-Dio @ 06.06.2018 14:34) но я бы не рекомендовал данный протокол к использованию, хотя просто, но не корректно- там, где ПЦР, следует секвенить, а тут ПЦР по всей плазмиде идет. КТо знает, что у Вас там случится в ходе ПЦР. Строго говоря, получается не полностью охарактеризованный результат мутагенеза. Не говоря уж о том, что данный фокус не на всякой плазмиде пройдет, так-то. Я всегда делаю мутагенез в стандартной плазмиде, типа pCR-Blunt, pBluescript etc. Затем вставка полностью секвенируется и переклонируется. Мутировать что либо в конечной целевой плазмиде конечно не стоит. Сообщение было отредактировано ship - 06.06.2018 19:38 |
R-J-Dio Постоянный участник |
|
criplenie Участник |
(R-J-Dio @ 06.06.2018 17:34) но я бы не рекомендовал данный протокол к использованию, хотя просто, но не корректно- там, где ПЦР, следует секвенить, а тут ПЦР по всей плазмиде идет. Ни разу не встречал ошибок после Q5 и PfuUltra. С такой же вероятностью плазмида может мутировать уже внутри бактерии. К тому же если мутация затрагивает ориджин или маркер устойчивости то колония просто не вырастет. А промотор с целевым белком и так секвенируются (но это скорее перестраховка, при клонировании накосячить проще чем при подобном мутагенезе). Конечно, может еще копийность плазмиды измениться, но это крайне маловероятно. |
criplenie Участник |
(ship @ 06.06.2018 17:43) Не ссы, Димон, я уже тыщу раз так делал. © Запаришься переклонировать если аланиновый сканинг делаешь. |
Esya Постоянный участник PA, USA |
просто надо планировать так, чтобы от одного ложно-отрицательного или псевдо-положительного результата конечный результат не страдал - мишень должна быть большой, когда может и промажешь слегка, но не в молоко а не по старинке, мы будем мутировать эту аминокислоту месяц, чтобы понять, что это была неправильная аминокислота, надо было другую еще месяц, но зато без побочных мутаций |
NMR-guy Постоянный участник временной жизни |
(ship @ 06.06.2018 16:43) Я всегда делаю мутагенез в стандартной плазмиде, типа pCR-Blunt, pBluescript etc. Затем вставка полностью секвенируется и переклонируется. Мутировать что либо в конечной целевой плазмиде конечно не стоит. Фига вы там богатые! Про аланиновых мутнтов уже сказали, но даже и без них - положено секвенировать конечный плазмидный результат, который идёт в библиотеку, если к нему еще и промежуточный добавлять... |
ship Постоянный участник Moscow |
(criplenie @ 10.06.2018 22:07) Не ссы, Димон, я уже тыщу раз так делал. © Запаришься переклонировать если аланиновый сканинг делаешь. выбор того, что и как делать всегда обусловлен целью и задачами, и имеющимися средствами. так что можно много разных примеров привести когда надо переклонировать и когда не надо. |
NMR-guy Постоянный участник временной жизни |
|
R-J-Dio Постоянный участник |
|
KCN Постоянный участник Київ. Україна понад усе! / DELETED |
1. Клонируем в вектор интересующий нас белок (кДНК с мРНК). 2. Подбираем праймеры с сайтом рестрикции и заменой пары нуклеотидов на 3' конце, чтобы попасть в рамку и заменить нужный а.к.з., считаем так по параметрам ПЦР чтобы температуры отжига и плавления позволяли использовать праймеры совместно. Праймеры длиной в среднем 20 нуклеотидов. 5' конец праймера должен быть интактный, так как на него ложится основная ответственность за специфичность связывания. Идеал мастерства - чтобы при помощи введенной в праймера мутации формировался новый сайт рестрикции, которого нет в векторе и вставке или очень мало. 3. Ставим препаративный ПЦР, получаем продукт, ставим рестрикцию и сшиваем, клонируем в вектор. 4. Проверяем вектор после наработки в бактериях рестриктазой по вновь образованному рестрикционному сайту и еще лучше сиквенированием. 5. Трансформируем эукариоту и добиваемся подавления указанного фермента доминант-негативной конструкцией. |
R-J-Dio Постоянный участник |
|
KCN Постоянный участник Київ. Україна понад усе! / DELETED |
|
R-J-Dio Постоянный участник |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |