Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Сайт-направленный мутагенез -- кит от NEB --
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! Нургуль551526




 прочитанное сообщение 04.06.2018 14:08     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Для проведения сайт-направленного мутагенеза по киту от NEB, используют киназу-лигазу и dpn 1. Вот для чего нужен процесс фосфорилирования тут?
вквик чэйндже там просто ДНК метилируют и все.
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 04.06.2018 19:41     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

Открою страшную тайну - киты для этого вообще не нужны.
Полимераза - любая высокоточная типа Pfx etc.
DpnI - просто фермент.
Компетешки - хоум-мейд.
Полная эмуляция квикченйдж. Работает на ура.

У НЕБ киназа нужна для того, что по их протоколу лигирование идет до трансформации в еколи, ну и соответственно концы надо фосфорилировать.

По квикчейндж лигирование идет в клетках еколи тк после ПЦР образуются кольцевые плазмиды с никами.

И дизайн праймеров существенно отличает, по квикчейндж праймеры комплементарые, а по Q5 протоколу - нет. Поэтому и надо лигировать перед трансформацией.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): criplenie
Участник оффлайн! R-J-Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 06.06.2018 16:34     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

но я бы не рекомендовал данный протокол к использованию, хотя просто, но не корректно- там, где ПЦР, следует секвенить, а тут ПЦР по всей плазмиде идет. КТо знает, что у Вас там случится в ходе ПЦР. Строго говоря, получается не полностью охарактеризованный результат мутагенеза. Не говоря уж о том, что данный фокус не на всякой плазмиде пройдет, так-то.
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 06.06.2018 16:43     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

(R-J-Dio @ 06.06.2018 14:34)
Ссылка на исходное сообщение  но я бы не рекомендовал данный протокол к использованию, хотя просто, но не корректно- там, где ПЦР, следует секвенить, а тут ПЦР по всей плазмиде идет. КТо знает, что у Вас там случится в ходе ПЦР. Строго говоря, получается не полностью охарактеризованный результат мутагенеза. Не говоря уж о том, что данный фокус не на всякой плазмиде пройдет, так-то.

Я всегда делаю мутагенез в стандартной плазмиде, типа pCR-Blunt, pBluescript etc. Затем вставка полностью секвенируется и переклонируется.
Мутировать что либо в конечной целевой плазмиде конечно не стоит.

Сообщение было отредактировано ship - 06.06.2018 19:38
Участник оффлайн! R-J-Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 06.06.2018 17:42     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

это правильно, но не всегда возможно, иногда приходится мутить какое-нить приличного размера г..., где ни сайтов удобных, ничего, а мутацию- вынь да положь. Никакие NEBы с квикчэнжами не спасут
Участник оффлайн! criplenie
Участник



 прочитанное сообщение 11.06.2018 00:03     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

(R-J-Dio @ 06.06.2018 17:34)
Ссылка на исходное сообщение  но я бы не рекомендовал данный протокол к использованию, хотя просто, но не корректно- там, где ПЦР, следует секвенить, а тут ПЦР по всей плазмиде идет.

Ни разу не встречал ошибок после Q5 и PfuUltra. С такой же вероятностью плазмида может мутировать уже внутри бактерии. К тому же если мутация затрагивает ориджин или маркер устойчивости то колония просто не вырастет. А промотор с целевым белком и так секвенируются (но это скорее перестраховка, при клонировании накосячить проще чем при подобном мутагенезе).
Конечно, может еще копийность плазмиды измениться, но это крайне маловероятно.
Участник оффлайн! criplenie
Участник



 прочитанное сообщение 11.06.2018 00:07     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

(ship @ 06.06.2018 17:43)
Ссылка на исходное сообщение 
Мутировать что либо в конечной целевой плазмиде конечно не стоит.

Не ссы, Димон, я уже тыщу раз так делал. ©
Запаришься переклонировать если аланиновый сканинг делаешь.
Участник оффлайн! Esya
Постоянный участник
PA, USA



 прочитанное сообщение 11.06.2018 00:40     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес  ICQ
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

отличный кит, вставить 90 нуклеотидов за день работы, через день уже тестировать продукт

просто надо планировать так, чтобы от одного ложно-отрицательного или псевдо-положительного результата конечный результат не страдал - мишень должна быть большой, когда может и промажешь слегка, но не в молоко lol.gif

а не по старинке, мы будем мутировать эту аминокислоту месяц, чтобы понять, что это была неправильная аминокислота, надо было другую еще месяц, но зато без побочных мутаций
Участник оффлайн! NMR-guy
Постоянный участник
временной жизни



 прочитанное сообщение 11.06.2018 04:25     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

(ship @ 06.06.2018 16:43)
Ссылка на исходное сообщение  Я всегда делаю мутагенез в стандартной плазмиде, типа pCR-Blunt, pBluescript etc. Затем вставка полностью  секвенируется и переклонируется.
Мутировать что либо в конечной целевой плазмиде конечно не стоит.

Фига вы там богатые!
Про аланиновых мутнтов уже сказали, но даже и без них - положено секвенировать конечный плазмидный результат, который идёт в библиотеку, если к нему еще и промежуточный добавлять... rolleyes.gif
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 11.06.2018 17:20     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

(criplenie @ 10.06.2018 22:07)
Ссылка на исходное сообщение  Не ссы, Димон, я уже тыщу раз так делал. ©
Запаришься переклонировать если аланиновый сканинг делаешь.

выбор того, что и как делать всегда обусловлен целью и задачами, и имеющимися средствами.
так что можно много разных примеров привести когда надо переклонировать и когда не надо.
Участник оффлайн! NMR-guy
Постоянный участник
временной жизни



 прочитанное сообщение 12.06.2018 00:45     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

Ну да, экспрессия нужна не всему.
Участник оффлайн! R-J-Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 13.06.2018 11:18     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

единство формы и содержания, как учили классики. С этим никто и не спорит
Участник оффлайн! KCN
Постоянный участник
Київ. Україна понад усе! / DELETED



 прочитанное сообщение 28.09.2018 10:28     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

Несколько раз делал белки-мутанты по одному из активных центров с заменой полярных заряженных аминокислот на гидрофобику. В для использования в доминант-негативных конструкциях в челночных векторах. Алгоритм такой:
1. Клонируем в вектор интересующий нас белок (кДНК с мРНК).
2. Подбираем праймеры с сайтом рестрикции и заменой пары нуклеотидов на 3' конце, чтобы попасть в рамку и заменить нужный а.к.з., считаем так по параметрам ПЦР чтобы температуры отжига и плавления позволяли использовать праймеры совместно. Праймеры длиной в среднем 20 нуклеотидов. 5' конец праймера должен быть интактный, так как на него ложится основная ответственность за специфичность связывания.
Идеал мастерства - чтобы при помощи введенной в праймера мутации формировался новый сайт рестрикции, которого нет в векторе и вставке или очень мало.
3. Ставим препаративный ПЦР, получаем продукт, ставим рестрикцию и сшиваем, клонируем в вектор.
4. Проверяем вектор после наработки в бактериях рестриктазой по вновь образованному рестрикционному сайту и еще лучше сиквенированием.
5. Трансформируем эукариоту и добиваемся подавления указанного фермента доминант-негативной конструкцией.
Участник оффлайн! R-J-Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 28.09.2018 13:29     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #14 множественное цитирование

а сайт новый зачем? в целом , в чем новация, о чем разговор вааще, что нового вы сказали миру?
Участник оффлайн! KCN
Постоянный участник
Київ. Україна понад усе! / DELETED



 прочитанное сообщение 28.09.2018 15:30     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #15 множественное цитирование

Сайт зачем? Дак чтобы проверять было удобно, мутировал или не мутировал.
Участник оффлайн! R-J-Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 06.10.2018 00:14     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #16 множественное цитирование

это я понимаю, но ЗАЧЕМ?
Участник оффлайн! watchesbiz
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  12.11.2021 19:05     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #17 множественное цитирование

https://wanelo.co/replicarolexwatches
https://musescore.com/fakerolexwatches
https://www.racked.com/users/Replicarolexwatches
https://sketchfab.com/Rolexrelicawatches
http://www.video-bookmark.com/bookmark/433...eplica-watches/
https://www.slideserve.com/ReplicawatchesUK...pt-presentation
https://www.theverge.com/users/Replicarolexwatches
https://www.yumpu.com/en/document/read/6532...lica-watches-uk
https://online.flippingbook.com/view/152275247/
https://www.instapaper.com/p/8767342
https://www.bigblueview.com/users/Replicarolexwatches
https://weheartit.com/watcheshutuk
https://sites.google.com/view/replicarolexwatches24/home
https://www.indiehackers.com/post/hints-on-...atch-113aef73a9
http://replicawatchesuk.esportsify.com/for...ica-rolex-watch

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 29.03.24 14:19
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft