 * |   |
|
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда |  Zbio-wikiNG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: |
|
Правила
* Нужна помощь с трансформацией дрожжей -- S cerevisiae --
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.
   |
|
guest: Наташа IP-штамп: frZeUnLdP7zXs гость  |
 15.12.2009 01:46
Никто с такой бедой не встречался? Заранее спасибо! Наташа |
 papa KarloПостоянный участник |
15.12.2009 02:34
|
|
VKV Участник |
15.12.2009 05:51
Проблема скорее всего в плазмиде. (может быть там URA3, а не LEU2) |
|
Guest IP-штамп: frwqWeYNjvnMg гость |
15.12.2009 06:12
Беда в том, что плазмид несколько - p53GAD (p53 in pGAD vector) и pAct - обе с Leu2, но результаты идентичные: если после трансформации клетки не разбавлять, то на лейциновых чашках что-то вырастает, тогда как на триптофановых (соответственно, трансформация pHis или pGBT9) - газон. Обычно разбавляю в десять раз, но тогда на лейциновых вообще ничего не растет. В pAct - две библиотеки, сделанные в разных лабораториях Правда, они довольно старые (такие старые, что в этих лабораториях уже не найти тех людей, которые библиотеку делали). А вот плазмида pGAD - свежая, к тому же коммерческая (Clontech). Так что мне кажется, что тут какая-то беда поглобальнее негодной плазмиды. |
|
Esya Постоянный участник PA, USA |
15.12.2009 07:31
А дикий-то штамм на ваших чашках растет, проверяли? |
|
Guest IP-штамп: frwqWeYNjvnMg гость |
15.12.2009 07:39
Дикого штамма у меня нет, так что не проверяла. Но на "соседских" чашках, которыми со мной поделились и на которых все, что должно расти, произрастает, после моей трансформации тоже ничего не зреет. Эх... |
|
Esya Постоянный участник PA, USA |
15.12.2009 08:09
|
|
ship Постоянный участник Moscow |
15.12.2009 13:20
так не растет ничего при трансформации бибилиотеки? или какой то конкретной pACT2 плазмиды? c pGAD-p53 тоже не растет? белок, кодируемый pACT2 может быть токсичен для дрожжей -поэтому ничего не растет. ну и методику трансформации можно было бы привести. штамм Y187 очень медленно растет, поэтому при постановке трансформации его надо подольше наращивать чтобы клеток было достаточно для эффективной трансформации. |
|
Guest IP-штамп: frq1KiHyl.SrA гость |
15.12.2009 18:22
Проблема сводится примерно к следующему. При прочих равных условиях, как то: - линия дрожжей (две опробованы: Y187 и W303) - условия роста (30С, 250rpm) - протокол трансформации (стандартная методика с помощью ацетата лития) на чашках с селекцией по триптофану (трансформация pHis или pGBT9) колонии растут (эффективность трансформации 1.5-3 x 10 in 5), а по лейцину (две библиотеки в pAct или коммерческая плазмида p53GAD) - растут крайне плохо (эффективность раз в 100 ниже). Возможных глобальных причин мне видится три: 1) Либо беда с ДНК (но тогда это проблема с тремя независимыми плазмидами, что мне кажется маловероятным) 2) Либо с селективной средой (кит свежий, по идее должен работать, но я и на чужих чашках проверяла - они не лучше моих, как выяснилось) 3) Либо с самой трансформацией (которая, в таком случае, как-то специфически не проходит только с "лейциновыми" плазмидами...) Я не специалист по дрожжам, вообще впервые ими занимаюсь. Надеялась, что, может, у кого была похожая проблема, или есть профи, которые подскажут, на что обратить внимание. Может, и не стоит гнаться за одинаковой эффективностью (как я уже писала, если клетки не разбавлять после трансформации, то какие-то колонии вырастают; правда, в таком случае есть хороший шанс потерять хорошую долю скринированного материала)... К примеру, товарищи в той лабе, что чашки мне дали, эффективность трансформации вообще никогда не высчитывают. Да им это, вроде, и не нужно. В общем, если какие-то мысли возникнут по данному поводу, буду очень благодарна. Наташа З.Ы. Ship, это хорошо, что Вы сказали про Y187: когда W303 попробовала, поняла, что Y187 растут медленнее, но не знала, что это для них нормально. Спасибо! |
|
ship Постоянный участник Moscow |
16.12.2009 00:10
вообще-то для трансформации библиотеки стандартный протокол не подходит, там специфический протокол нужен. Советую посмотреть мануал по Matchmaker системам от Clontech. Может есть у них на сайте. Ну а если просто одну плазмиду засунуть -то зачем высокая эффективность?? достаточно несколько колоний. |
|
guest: Наташа IP-штамп: frq1KiHyl.SrA гость |
16.12.2009 01:02
А протокол у меня как раз от MatchMaker, самый, кстати сказать, стандартный, с той только разницей, что MatchMaker предлагает проводить ко-трансформацию готовой плазмидой и "полуфабрикатом" библиотеки (кДНК с линейным вектором, которые рекомбинируют уже в дрожжах). Но последнего я не делаю, потому как библиотеку, уже клонированную в вектор, нам подарили, так что по идее все должно быть еще проще. По идее, мда. |
|
VKV Участник |
16.12.2009 01:08
|
|
guest: Наташа IP-штамп: frq1KiHyl.SrA гость |
16.12.2009 01:13
|
|
guest: superslot IP-штамп: frFlcfgzvDvpg гость |
 06.06.2021 21:16
|
|
pg IP-штамп: frUrnbuiikZ.M гость |
14.08.2021 11:18
|
|
guest: pgslot IP-штамп: frUrnbuiikZ.M гость |
14.08.2021 11:21
|
|
พีจี IP-штамп: frUrnbuiikZ.M гость |
14.08.2021 11:22
|
|
watchesbiz Постоянный участник |
26.08.2021 02:54
|
|
watchesbiz Постоянный участник |
23.09.2021 06:46
|
| « Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |
 |
· Викимарт - все интернет-магазины в одном месте · Доска объявлений Board.com.ua ·
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---
Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Powered by Invision Power Board(Trial) v2.0.0 © 2024 IPS, Inc.