Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Pharmaсol Постоянный участник |
Полученные препараты ДНК-комет окрашивают флуоресцирующими с ДНК красителями и микроскопируют. Цифровые изображения анализируют с использованием специализированного программного обеспечения. В качестве показателя поврежденности ДНК используется процентное содержание ДНК в хвосте (%DNA in tail) или момент "хвоста" (tail moment), соотношение первого к длине "хвоста". это же изображение, анализируемое с помощью CASP 1.2.2. Существует ряд модификаций метода, позволяющих определять уровень одно- двунитевых разрывов, интенсивность репаративных процессов в клетках, уровень модифицированных оснований и ДНК-аддуктов, а также оценивать апоптотические и некротические клетки. На фотографии: лимфоциты человека, обработка перекисью водорода (40 мкМ, 5 мин) с последующей обработкой hOGG1 (Метод FLARE comet для оценки уровней 8-oxoguanine) Сообщение было отредактировано Pharmaсol - 11.04.2010 16:06
|
Olia Brie |
Спасибо за ответ. |
Moulder |
|
Pharmaсol Постоянный участник |
|
Guest IP-штамп: frsVQGBYzvTYE гость |
Пожалуйста, киньте ссылку на протокол,который используете Вы. Необходимо ли после нейтрализации пред окраской проводить препарат через спирты? Коммерческие электрофоретические наборы для comet assay содержат охлаждающую систему для уменьшения диффузии ДНК при нагревании ячейки, если охлаждать льдом, улучшатся ли результаты? Какую программу Вы используете для определения момента хвоста? Заранее спасибо. |
VVolkov Постоянный участник |
|
Sn IP-штамп: frMqP6RPm1mxU гость |
момента хвоста? Где лучше скачать? |
Pharmaсol Постоянный участник |
2) Что значит улучшаться результаты? Охлаждение используется чтобы стандартизовать условия фореза, но как показывает практика, при низких температурах денатурации и фореза чувствительность метода падает (по этому поводу готовится статья). Мы проводим денатурацию и форез при комнатной температуре 20-25С, повторяемость результатов высокая. Не заморачивайтесь, купите обычную камеру для фореза. 3) момент хвоста не очень "хороший" показатель, лучше %ДНК в хвосте. До сего момента мы использовали |
L-2M Постоянный участник |
|
Pharmaсol Постоянный участник |
|
Guest IP-штамп: frgsE2/VcFQ2Y гость |
(Pharmaсol @ 09.04.2010 15:32) "Комет ассаей" , как кометы - раз в 2010 лет от рождества Так ,что ждите |
Guest IP-штамп: frsVQGBYzvTYE гость |
|
snegin Участник |
Картинки: Железо.JPG — (2.34мб) 10.04.2010 — 24.04.2010 |
snegin Участник |
Картинки: костный_мозг.JPG — (1.41мб) 10.04.2010 — 24.04.2010 |
VVolkov Постоянный участник |
|
Pharmaсol Постоянный участник |
|
snegin Участник |
Картинки: Контроль.JPG — (2.39мб) 10.04.2010 — 24.04.2010 |
Pharmaсol Постоянный участник |
|
VVolkov Постоянный участник |
|
snegin Участник |
Господину VVolkov - советую прочитать об этом методе, прежде чем задавать дурацкие вопросы. |
VVolkov Постоянный участник |
Зачем Вы метод применяете? Я такие же картинки могу отфотошопить или фломастером накалякать. Что здесь различается, где статистика? На глаз ничего не видно, разные оттенки зеленого и пятнышки желтые. Я пока еще не господин для Вас, а коллега могу быть. Это к Папе Карле, он художник. )) Декаденс и деградация! ))) А полоски в контроле - это ногтями от бессилия по стеклу царапали? )) А с нано - там нитку сургучную для антуражу добавили? )) Перфоманс такой. ))) |
VVolkov Постоянный участник |
|
VVolkov Постоянный участник |
|
Pharmaсol Постоянный участник |
(snegin @ 10.04.2010 15:43) Переходите на Сибр (VVolkov @ 10.04.2010 14:48) Действительно интересно, или так, праздное любопытство? Сообщение было отредактировано Pharmaсol - 10.04.2010 19:05 |
марья лагарькова IP-штамп: frUPCqrj.oJg. гость |
Метод ОЧЕНЬ тонкий и артефактов всяких - не перечислить. Как для денатурирующего, так и для неденатурирующего геля. С лимфоцитами еще ничего, а, например, применительно к ЭСК - вообще не работает, так как кометы получаются и на интактных клетках (и не приводите, пожалуйста, ссылки, где работает - они спорны, на мой взгляд). Честно говоря, качество как комет, так и их фотографий у snegin не очень высокое. Думаю, что дело даже в основном именно в качестве фото - такое очень трудно будет обсчитать. Марья P.S. После нескольких лет перерыва зашла на форум в молбиоле. Господин VVolkov , хамство - не лучший способ общения. Из-за безобразного тона обсуждений на форуме многие мои товарищи перестали заходить на сайт. Господа молодые коллеги, как можно терпеть такую манеру разговора? Думаю, что обращусь к Леше Солдатову с просьбой вычистить помойку с сайта, а то очень за молодое поколение стыдно...
|
Pharmaсol Постоянный участник |
(марья лагарькова @ 10.04.2010 21:39) Коллеги, этому новому методу уже достаточно много лет. Метод ОЧЕНЬ тонкий и артефактов всяких - не перечислить. я бы сказал нюансов (марья лагарькова @ 10.04.2010 21:39) а, например, применительно к ЭСК - вообще не работает, так как кометы получаются и на интактных клетках (и не приводите, пожалуйста, ссылки, где работает - они спорны, на мой взгляд). мы делали МСК, нормально получалось, могу картинку выложить. Про ЭСК ничего сказать не могу (марья лагарькова @ 10.04.2010 21:39) Честно говоря, качество как комет, так и их фотографий у snegin не очень высокое. Думаю, что дело даже в основном именно в качестве фото - такое очень трудно будет обсчитать. согласен, надо поработать с качеством препаратов PS коллеги, хочу поделиться ссылкой на книжку Dhawan A.,Anderson D.(eds.) The Comet Assay in Toxicology (RSC, 2009), найденной в глубинах инета Сообщение было отредактировано Pharmaсol - 21.04.2010 21:09
|
VVolkov Постоянный участник |
У нас как-то одна китайская аспирантка аж рыдала после такой беседы. И ничего - защитилась, потом только спасибо говорила. Фотографии выложены отвратительного качества - так и надо сказать. Их нереально, ИМХО, где-либо опубликовать и по ним ничего не посчитать. Мой интерес привлекло название метода на русском, оно не соответствует содержанию. Интерес к оценке свечения - в биологии, ИМХО, в хороших работах картинками нельзя обойтись. Нужны количественные показатели - для сравнения и измерения. К сожалению, даже во многих работах по cell biology такие измерения упускаются, что снижает качество работ. |
Pharmaсol Постоянный участник |
|
VVolkov Постоянный участник |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(марья лагарькова @ 10.04.2010 21:39) Марья P.S. После нескольких лет перерыва зашла на форум в молбиоле. Господин VVolkov , хамство - не лучший способ общения. Из-за безобразного тона обсуждений на форуме многие мои товарищи перестали заходить на сайт. Господа молодые коллеги, как можно терпеть такую манеру разговора? Думаю, что обращусь к Леше Солдатову с просьбой вычистить помойку с сайта, а то очень за молодое поколение стыдно... Я тоже давно говорю. что "лесную собаку" давно пора посадить на цепь. |
snegin Участник |
То что препараты не идеальные, это я сам вижу. Начали эту методику осваивать в этом году, поэтому многие ньюансы еще придеться учитывать. Как говориться набиваем шишки. Что касается спинного мозга, то я уже обсуждал эту тему на форуме. У нас действительно в контрольных крысах получалось много комет, но все равно несоизмеримо меньше с подопытными. Пока очень большая проблема хорошо отмацерировать ткань, во многих препаратах клетки (ядра) оказываются слипшимися. Кроме того, много грязи на препаратах (как избавиться?). Как вы верно заметили большой фон (как уменьшить?). |
snegin Участник |
То что препараты не идеальные, это я сам вижу. Начали эту методику осваивать в этом году, поэтому многие ньюансы еще придеться учитывать. Как говориться набиваем шишки. Что касается спинного мозга, то я уже обсуждал эту тему на форуме. У нас действительно в контрольных крысах получалось много комет, но все равно несоизмеримо меньше с подопытными. Пока очень большая проблема хорошо отмацерировать ткань, во многих препаратах клетки (ядра) оказываются слипшимися. Кроме того, много грязи на препаратах (как избавиться?). Как вы верно заметили большой фон (как уменьшить?). |
snegin Участник |
То что препараты не идеальные, это я сам вижу. Начали эту методику осваивать в этом году, поэтому многие ньюансы еще придеться учитывать. Как говориться набиваем шишки. Что касается спинного мозга, то я уже обсуждал эту тему на форуме. У нас действительно в контрольных крысах получалось много комет, но все равно несоизмеримо меньше с подопытными. Пока очень большая проблема хорошо отмацерировать ткань, во многих препаратах клетки (ядра) оказываются слипшимися. Кроме того, много грязи на препаратах (как избавиться?). Как вы верно заметили большой фон (как уменьшить?). |
snegin Участник |
То что препараты не идеальные, это я сам вижу. Начали эту методику осваивать в этом году, поэтому многие ньюансы еще придеться учитывать. Как говориться набиваем шишки. Что касается спинного мозга, то я уже обсуждал эту тему на форуме. У нас действительно в контрольных крысах получалось много комет, но все равно несоизмеримо меньше с подопытными. Пока очень большая проблема хорошо отмацерировать ткань, во многих препаратах клетки (ядра) оказываются слипшимися. Кроме того, много грязи на препаратах (как избавиться?). Как вы верно заметили большой фон (как уменьшить?). |
Pharmaсol Постоянный участник |
(snegin @ 12.04.2010 15:49) дык, это.... ссылка вроде бесплатная, качайте (snegin @ 12.04.2010 15:49) Кроме того, много грязи на препаратах (как избавиться?). Как вы верно заметили большой фон (как уменьшить?). Как уже говорил, меняйте краситель (на SYBR Green), убъете двух зайцев - и фон исчезнет, и грязь краситься не будет. |
snegin Участник |
|
Pharmaсol Постоянный участник |
Сообщение было отредактировано Pharmaсol - 12.04.2010 17:03 |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(snegin @ 12.04.2010 17:48) Я отправлю в личку, если не удасться скачать. |
guest: snegin IP-штамп: frMqP6RPm1mxU гость |
|
semi Постоянный участник Москва |
Про картинки в топик-старте: В ряде комет есть мощные зоны пересвета в "голове" кометы. Насколько это может влиять на точность измерений? И каким образом выбирается время экспозиции? |
Pharmaсol Постоянный участник |
|
snegin Участник |
Маленький вопрос где Sybr дешевле, и чтоб качество было приемлемое. Картинки: Лейкоциты.JPG — (1.46мб) 16.04.2010 — 30.04.2010 |
Pharmaсol Постоянный участник |
|
VVolkov Постоянный участник |
|
Pharmaсol Постоянный участник |
to snegin: а почему вы снимаете кометы хвостом налево? известные мне программы для комет работает с обратной ориентацией Сообщение было отредактировано Pharmaсol - 17.04.2010 02:10 |
snegin Участник |
to VVolkov - пистолеты наготове. |
snegin Участник |
|
Pharmaсol Постоянный участник |
(snegin @ 17.04.2010 18:36) Да, еще одна проблемка нарисовалась. После щелочной денотурации иногда агароза подложки отстает от стекла (чуть не доглядел и слетела вместе с препаратом), хотя обезжириваем все стекла одинакого (спирт+эфир). Процентность первого и второго слоев агарозы? Темература геля при нанесении? |
VVolkov Постоянный участник |
|
snegin Участник |
Препарат - 1% раствор легкоплавкой агарозы в ФСБ (Тпл=42 С) Наносим при 42 С. Охлаждаем на холодильном элементе. Я уже писал, что некоторые препараты пытаются слететь. Приходиться быть очень осторожным, когда из камеры переносим в спирт. Для этого сначала отбираем электродный буфер, до тех пор пока не появятся стекла. Но и это порой не помогает. |
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |