Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Uri |
Из-за чего такое бывает? Подбирали разные условия: обороты от 160 до 200, Т от 30 до 37, делали в день и в ночь. На ИФА белок взаимодействует на тройку, но форезе на нужной длине нет того белка. Трансфомировали на клетках JM103, а экспрессировали на клетках BL21. Заклонированный фрагмент белка гликопротеина одного вируса |
Esya Постоянный участник PA, USA |
подбирать штаммы но нужная длина - понятие расплывчатое, плюс-минус |
Uri |
не понял только про мембранную фигню |
Esya Постоянный участник PA, USA |
а вестерн делали? |
Tuco Ramires Постоянный участник Rio Grande |
|
Uri |
|
Uri |
И как Вы с этим разбирались? |
ernesta88 Постоянный участник москва |
|
Tom1 Постоянный участник |
надо брать не BL21 but BL21 (DE3) or Rosetta2 BL21 DE3 как-то туко... |
ernesta88 Постоянный участник москва |
|
Guest IP-штамп: frxbj0K9xj17w гость |
(Uri @ 28.05.2013 12:02) А чего тут разбираться? Проверили экспрессию в нескольких штаммах, выбрали тот, в котором уровень экспрессии нас устраивал, пустили в работу именно эту комбинацию "штамм+конструкция". Собственно, все... (ernesta88 @ 28.05.2013 15:51) Это да, но я в своей работе поостерегся бы иметь дело с такими людьми... |
ernesta88 Постоянный участник москва |
________ имхо есть куда бОльшие недостатки - про ДЕ3 можно прочитать, а другие недостатки не выбьешь ничем кроме пули в голову)) ваще еще слова о "фрагмент" наводят на мысль, что белок мал - если меньше 5-7 кДа то тяжело эксрпрессировать, надо фьюз так или иначе стартовых данных мало чтоб понять в чем там дело. |
Esya Постоянный участник PA, USA |
|
criplenie Участник |
(Uri @ 28.05.2013 07:47) А Т7-полимераза видна? Вес около сотни kDa. Штаммы бывает DE3 теряют. |
ernesta88 Постоянный участник москва |
1) в нативных условиях выделяли или в денатурирующих (может растворимого нет, а в тельцах включения - куча) 2) предполагаемый MW белка (опять же, мелкие белки эксрпессируются плохо) 3) как анализировали экспрессию (иногда нужную полосу можно проглядеть если сравнивать лизаты до и после) 4) на форезе на нужной длине - опять же - элюаты или лизаты? ну и кстати, раз уж в ИФА есть какая-то реакция, значит какая-то экспрессия идет, белок синтезируется и значит штамм таки(скорей всего) ДЕ3, |
R.J. Dio Постоянный участник |
2) возможно, неоптимальная структура 5'- конца РНК блокирует последующую трансляцию, иными словами, структура RBS-ген нехороша. Некоторые фирмы, синтезирующие гена de novo, дизайнят не только ген под конкретный организм, но и upstream область. Для вас- перекинуть ген в другой экспрессионный вектор, скажем pQE, может, станет лучше |
ernesta88 Постоянный участник москва |
|
R.J. Dio Постоянный участник |
|
Uri |
Экспрессировали в 8М мочевине. ernesta88, в нативных условиях может нужный белок не раствориться? Масса фрагмента должна быть от 29.8 до 32 кДа в зависимости от рамки с которой начнется считывание после промотора, естественно, что ожидали более длинный белок то есть ~ 32 кДа. T7 полимераза есть и еще много разных полос. Экспрессию делали со свежих чашек и стоков. Паралельно делали экспрессию другого белка, другой конструкции и там на нужной длине была хорошая полоса. На форезе анализировали и лизаты и элюаты. Здесь же на нужной длине ничего не видно, видно что-то на 38 кДА и на 20 кДа, а между ними вообще нет бендов. Но при этом в ИФА все отлично взаимодействует и хорошо титруется с 3 до 0.392. К сожалению нет возможности на Ni-колонке все очистить. Говорят что можно с имидазолом, кто знает эффективно ли это? 2R.J. Dio: это несинтезированный ген, это ген полученный обычным ПЦРом. Всем большое спасибо!! |
R.J. Dio Постоянный участник |
|
ernesta88 Постоянный участник москва |
_______ а почему нет возможности очистить? нет агарозы? регулярно чищу имидазолом (20 мМ, 50мМ - промывка, 350 мМ - элюция) (а не градиентом рН) с ни-нта, все ок, так и в руководстве (например погуглите Ni-NTA invitrogen probond написано). в нативных условиях да, многое и очень часто не растворяется т.к. уходит в тела включения к-е растворяются только мочевиной и др.. можно выделить в денатурирующих условиях (8М мочевина), а потом ренатурировать. кстати говоря - на 20 кДа, это полоска стандартного контаминанта SlyD, - на 38 - посчитайте, может быть к вашему белку добавилась масса тэгов, которые все равно есть в 28 и 29 - в зависимости от того, по какому сайту вы клонировали эээ...а что значит экспрессировали в 8М мочевине? то есть чистили в смысле? и обязательно надо сделать блот, тк только он поможет понять где ваш белок - может это те самые 38 УПД: по каким сайту вы все ж клонировали? |
Tom1 Постоянный участник |
жескач.... "Но при этом в ИФА все отлично взаимодействует и хорошо титруется с 3 до 0.392. " антитела на что на таг или на белок???? ставить "ифу" на грубом лизате колеи имха себя не любить... если даже поверить что имеет быть место спейцифика то какая чуйствительность "ифы"??? то-то.... да исчо кучка центофф... если сие гликопротеин вполне возможно что он ясен арафат не гликозилируется и в связи с ентим : а) падает в тельца; б) быстренько деградирует в связи не не правильным фолдингом... " Т от 30 до 37," у сие не есть подбор температур.... если допустить что идет в тельца то имха следует снижать Т до 22, 20, 15 градусофф, один мои кореш добился вразумительного кол-ва однои киназы ( человеческой) при +4... да и имха снизьте ИПТГ до 0.1мМ помогает... "К сожалению нет возможности на Ни-колонке все очистить. Говорят что можно с имидазолом, кто знает эффективно ли это?" исчо одна жесть жестянная... имха пассажир очень отдаленно представляет что есть хроматография на металл-хелатнои резине... интересно что он имеет ввиду???? что у него мало сорбента дык там ебкость вполне приличная или сорбента совсем нет??? и интересно если сорбент есть чрм елюировали , нет я знаю что можно и пахом, и хлористым аммонием 9 если нет иммидазола или обьем колонку от литра и выше) имха короче ( ударение на последнюю быкву) пассажиру матчасть подучить бы в начале... |
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |