Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
jelenarus |
Скажите, пожалуйста, от чего появляются экстра бенды после рестрикции? При чем нужные фрагменты есть, но все таки смущает неспицифика. Плазмида та, с ней же ставила ПЦР и она идёт нормально. Использую ферменты XbaI , SphI, Cut Smart Buffer, концентрацию ДНК меняла по-разному, картина практически не меняется Сообщение было отредактировано jelenarus - 27.06.2018 18:42 |
MMM Постоянный участник |
Неспецифичные плохие рестриктазы Перегруз по рестриктазам. |
R-J-Dio Постоянный участник |
|
Esya Постоянный участник PA, USA |
так же полезно бы знать размер полос, это может быть как недогрыз так и перегрыз (что врядли, катсмарт, вроде) |
Tom1 Постоянный участник |
|
jelenarus |
(R-J-Dio @ 28.06.2018 01:31) если CutSmart, то, очевидно рестриктазы NEB, родные, вряд ли плохие. Без картинки сказать ничего конкретного гельзя, может, это и не неспецифика вовсе. перво-наперво, надо параллельно наносить нерезанный контроль, то есть ту же плазмиду в тех же кол-вах и в том же буфере, инкубированную так же, только без фермента. после этого можно хоть о чем-то говорить. А аообще, Вам надо руку ставить сначала, а потом все остальное Я уже какой раз пытаюсь скинуть картинку, но сайт не даёт, считает за спам |
jelenarus |
(R-J-Dio @ 28.06.2018 01:31) если CutSmart, то, очевидно рестриктазы NEB, родные, вряд ли плохие. Без картинки сказать ничего конкретного гельзя, может, это и не неспецифика вовсе. перво-наперво, надо параллельно наносить нерезанный контроль, то есть ту же плазмиду в тех же кол-вах и в том же буфере, инкубированную так же, только без фермента. после этого можно хоть о чем-то говорить. А аообще, Вам надо руку ставить сначала, а потом все остальное Оказывается, что можно и руку, и рестрикцию ставить параллельно |
R-J-Dio Постоянный участник |
|
Esya Постоянный участник PA, USA |
(R-J-Dio @ 28.06.2018 17:18) это для особо талантливых. моя первая руководительница говорила примерно так: все ученые делятся на 3 категории: первые, их крайне мало, они берут методику, читают, делают-и все получается. Вторые, большинство, берут методику, читают, делают, ошибаются, им объясняют, где ошибка, они делают, и получается. Есть и третья группа, тоже немалая....с ней уже понятно. я офигеваю от снобизма соотечественников в вопросах рестрикции да чему там получаться-то... чай, не дерьмовые ферменты 70-х в десятикратном разведении. Автору, выложите на какое-нибудь облако, а ссылку дайте без гиперлинка, а то умру от любопытства
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(Esya @ 29.06.2018 05:19) я офигеваю от снобизма соотечественников в вопросах рестрикции да чему там получаться-то... чай, не дерьмовые ферменты 70-х в десятикратном разведении. Автору, выложите на какое-нибудь облако, а ссылку дайте без гиперлинка, а то умру от любопытства Esya, Вы прямо витаете, небожитель, так сказать... И всегда стремитесь припасть к источнику! Кстати, о рестриктазах. И в 70-х рестриктазы от НЕБа были не "такие" . НЕБ и сейчас НЕБо Покупаю только попробовать, сравнить.
|
NMR-guy Постоянный участник временной жизни |
(jelenarus @ 27.06.2018 18:35) У Вас рестриктаза не только на геле лишние фрагменты оставляет. У Вас или в инсерте дополнительный сайт БЫЛ (сам по себе), или в ходе Вашего "мутагенеза" образовался. Первое более вероятно. Кстати, это бы объяснило почему у Вас шмер на геле - просто всё по липким концам наслипалось в тонны клубков ДНК прямо в растворе при RT. |
R-J-Dio Постоянный участник |
|
R-J-Dio Постоянный участник |
(-Ъ- @ 29.06.2018 11:39) Esya, Вы прямо витаете, небожитель, так сказать... И всегда стремитесь припасть к источнику! Кстати, о рестриктазах. И в 70-х рестриктазы от НЕБа были не "такие" . НЕБ и сейчас НЕБо Покупаю только попробовать, сравнить. кстати, NEBовские не такие дорогие, вполне можно себе позволить, если бы их еще по 2 месяца не везли на собаках. Но если вдолгую, то и это не важно, коллекция формируется, и все хорошо. Да и наши сибирские тоже норм. сейчас, особой разницы не вижу, они вполне окультурились за годы патронажа NEBа, классика колониализма |
jelenarus |
(R-J-Dio @ 29.06.2018 13:45) мы че обсуждаем- картинки нет? Столько всего навыдумывать можно. готов согласиться со всеми- но картинку бы поглядеть Вот, 2 - что получается , 1 - что в идеале должно быть Сообщение было отредактировано jelenarus - 29.06.2018 14:27 Картинки: 5A1211BE_82A3_4FA8_A35D_110586B92DC2.jpeg — (4.06мб) 35CF83F8_381B_4BC8_BA4B_B7966CD32B88.jpeg — (3.71мб) |
R-J-Dio Постоянный участник |
Все вышесказанное не отменяет того, что я говорил ранее- нужен контроль, что вы опять проигнорировали. Нерезаный контроль. Контроль- это ваше все, особенно на первых порах
|
jelenarus |
(R-J-Dio @ 29.06.2018 15:53) ну вот, все понятно. Спешу Вас обрадовать, у Вас абс. норм. рестрикция, целевая полоса жирная, все, что сверху- это скорее всего, геномка, которая не порезалась (да будет известно, что геномки при выделении плазмиды всегда прилично, зависит от способа и умения выделять плазмиду и от масштаба выделения, кстати, тоже, но это отдельная тема) либо такие формы плазмиды, которые не режутся никогда- всякие конкатамеры и пр, могу ошибаться в терминах. Словом, далее с этой полосой можно делать все, что угодно, вырезать из геля, резать следующими рестриктазами и пр. Все вышесказанное не отменяет того, что я говорил ранее- нужен контроль, что вы опять проигнорировали. Нерезаный контроль. Контроль- это ваше все, особенно на первых порах Ситуация была хуже, экстра бренды были везде. Я ставила инкубацию 37 - 1 час, почитала на разных форумах, писали, что это может быть incomplete digestion, а ферменты уже не супер свежие, поэтому я увеличила инкубацию до 2 часов и результат вот такой, как я скинула выше. Но все равно меня немного расстроил бенд сверху, поэтому я решила удостоверится. Спасибо за ответ) |
R-J-Dio Постоянный участник |
|
dk Постоянный участник Россия |
|
NMR-guy Постоянный участник временной жизни |
(R-J-Dio @ 29.06.2018 14:53) ну вот, все понятно. Спешу Вас обрадовать, у Вас абс. норм. рестрикция, целевая полоса жирная, все, что сверху- это скорее всего, геномка, которая не порезалась (да будет известно, что геномки при выделении плазмиды всегда прилично, зависит от способа и умения выделять плазмиду и от масштаба выделения, кстати, тоже, но это отдельная тема) либо такие формы плазмиды, которые не режутся никогда- всякие конкатамеры и пр, могу ошибаться в терминах. Словом, далее с этой полосой можно делать все, что угодно, вырезать из геля, резать следующими рестриктазами и пр. Все вышесказанное не отменяет того, что я говорил ранее- нужен контроль, что вы опять проигнорировали. Нерезаный контроль. Контроль- это ваше все, особенно на первых порах +1. Закрывайте тему, у Вас картинка почти идеальная. Ставьте смело до суток при RT, с 2 единицами каждого, если не уверены. Небовские ферменты, тем более эти два, которые в ходу не зря, не звездят. |
merry89 |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |