Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
uKaterina |
При выделении ДНК у нас возникла такая проблема: Перед инкубацией с додецилсульфатом мы сливаем цитратный буфер и добавляем ацетат натрия (pH 7.0). При этом раствор приобретает вид желелбразного сгустка. А после инкубации (после добавления фенол/хлороформной смеси и цетрифугирования) сама интерфаза оооочень сильно тянется и тянет за собой белковую фракцию. Может кто сталкивался? Подскажите, пожалуйста, что мы делаем не так!? |
MMM Постоянный участник |
|
dk Постоянный участник Россия |
|
uKaterina |
|
superuser |
Просто у вас такая особенность пробы. Ничего существенного не сделаешь. P.S.: Помимо происхождения пробы хорошо бы привести протокол выделения ДНК, и место его в эксперименте. |
MMM Постоянный участник |
(uKaterina @ 02.08.2018 07:00) ДНК выделяем из цельной крови фенол-хлороформным микрометодом (из 0,5 мл). В итоге получается не очень большая концентрация: 50-100 нг/мкл (для такого объема это не много). А протеиназу используете? |
uKaterina |
|
MMM Постоянный участник |
|
uKaterina |
Белок у нас в пробе (готовой растворенной ДНК) в пределах нормы: при измерении на 260/280 - 1,6-1,8, а раствор с ДНК все равно тянется. Протеиназу пробовали добавлять - не помогает. Для лизиса добавляем ацетат нария. |
uKaterina |
Файл/ы:
|
MMM Постоянный участник |
Протеиназу на 37 надо ночь держать, добавлять ее на час при 37 - это в пользу бедных. Если разбавлять пробу ацетатом, то не во время разделения фаз, а перед. В ацетате обязательно должен быть ЭДТА хотя бы 1 мМ, а лучше 5-10. Понять, что проба вязкая, можно еще до добавления фенола аккуратно ее пропипетировав перед нанесением на фенольную фазу. |
superuser |
Нужно подробно описать, как готовите цитратный буфер. И да, кстати, пробовали хоть раз считать лейкоциты? Также возможно придётся менять методику, тогда что можно попробовать для начала: 1) вместо цитратного буфера применить Трис-буфер (рН 7,4-7,6 соляной кислотой, хлорид магния или аммония, если не вводили ЭДТА в пробу, то включите его в этот буфер). Если нужен рецепт буфера - дайте знать; 2) вместо 0,7 мл крови внести 0,3 мл; 3) вышеуказанные 1) и 2) - совместно. Но, вы должны понимать, что прям вот "сияющую" ДНК получить очень маловероятно (как я писал - такова особенность вашей пробы), каким бы образом не работали: тянуться что-нибудь да как-нибудь из интерфазы будет всё равно. А если это будет не фенол-хлороформный метод, то вы должны понимать, что ДНК никогда не будет одна, такова особенность метода; хоть и называем процедуру "Выделение ДНК", на самом деле в итоговом растворе не только ДНК. Вы не указали также, почему вам мешают получающиеся у вас особенности реализации методики; не удаётся совсем продолжать исследование (не получается раствор ДНК получить) или нужна как можно большая очищенность, или что угодно ещё? P.S.: есть возможность иметь меркаптоэтанол? Сообщение было отредактировано superuser - 02.08.2018 22:29
|
dk Постоянный участник Россия |
|
Vadim Sharov Постоянный участник Россия |
(MMM @ 02.08.2018 12:24) Поддерживаю Вас. Протеинкиназа K, 55 градусов на ночь. Все белки в труху. 37 - это способ кроме протеазы еще и работу нуклеаз получить. Разверну ответ. Оптимум протеинкиназы К где -то 45. Мезотермофильный фермент. То есть 50-55-56 не совсем оптимально для протеинкиназы К, но для нуклеаз млекопитающих точно не оптимально. Поэтому если не пахать ночами перерыв как раз на переваривание. "Ночная" концентрация фермента может быть меньше. Но если работает, зачем оптимизировать. Каспазную апоптозную "лесенку" при 37 получить не могли (кто же публикует отрицательные результаты), при 50 градусной обработке получилась идеальная картинка. ЭФФЕКТЫ ИНГИБИТОРА КАСПАЗЫ-3 НА БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ АПОПТОЗА В ЗРЕЛОМ МОЗГЕ ПРИ ЕГО ЦЕНТРАЛЬНОМ ВВЕДЕНИИ Юрасов В.В., Грудень М.А., Сторожева З.И., Яковлева Н.Е., Маркина Е.В., Шаров В.И., Шерстнев В.В. Нейрохимия. 2007. Т. 24. № 4. С. 304-311. P.S. Сам наблюдал, когда использовали 55, а в статье писали рекомендованные в бамажке к ферменту 37
|
Guest IP-штамп: frsFk8oRU4ljA гость |
Все дело оказалось в рН ацетата (рН-метр нужно уже менять!). |
watchesonline89 Постоянный участник |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |