Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Sonya Kuznetsova Постоянный участник |
(Проблема такая: связываем клетки крови на иммобилизованные на поверхности антитела. Пробуем красить по методике, описанной для мазков крови (сушим, фиксируем Май-Грюнвальдом на метаноле, смываем, добавляем азур-эозиновую краску). Мазки красятся прекрасно, а часть клеток, связанных на антитела, при такой процедуре выплевывает цитоплазму.) |
Дядя ФАКСер Постоянный участник Nothern Maccaronia, Ticinum |
P.S. Антитела и анахронические методы с мазками...очень странное сочетание. Зачем? |
Sonya Kuznetsova Постоянный участник |
А по сути вопроса? Зачем сушат клетки перед фиксацией метанолом? Сообщение было отредактировано Sonya Kuznetsova - 09.04.2009 11:21 |
Дядя ФАКСер Постоянный участник Nothern Maccaronia, Ticinum |
"...Правила фиксации мазка. Фиксация мазка проводится в соответствии с методикой, обусловленной биологическим материалом, взятым для цитологического исследования (влажная фиксация биологического материала или подсушивание его на воздухе). При влажной фиксации приготовленный мазок помещается в фиксирующую жидкость, затем подсушивается на воздухе. Недостаточная фиксация мазка ведет к некачественному окрашиванию клеток. 1. Правильная фиксация мазка обусловливает стойкость клеток по отношению к содержащейся в красках воде, которая в нефиксированном мазке изменяет строение клеточных элементов. При фиксации мазка про-исходит коагуляция белка, в результате чего клетки прикрепляются к предметному стеклу; 2. При фиксации цитологических препаратов должны использоваться фиксаторы, прописи приготовления которых приводятся в соответствующих руководствах (1, 2, 3). 3. Рекомендуемые фиксаторы: - метиловый спирт; - этиловый спирт; - смесь Никифорова; - фиксатор Май-Грюнвальда; - фиксатор Лейшмана; - ацетон (для иммуноцитохимии). Лучшим фиксатором является метиловый спирт, на основе которого готовят фиксатор Лейшмана и Май-Грюнвальда. Правила окрашивания мазка. Качественное окрашивание позволяет правильно идентифицировать клеточные элементы мазка и оценить их особенности при микроскопии. В адекватно окрашенном мазке структуры цитоплазмы, ядра, ядерного хроматина, ядрышек окрашены элективно. 1. При применении любой методики окрашивания мазка важно точно соблюдать последовательность процедур приготовления растворов и временные промежутки в течение процесса окрашивания. 2. Существующие в продаже партии красителя имеют различную интенсивность окраски. Это обязывает опытным путем установить оптимальные концентрации (разведение) и время окрашивания для каждого флакона красителя, которые устанавливают при окрашивании серии препаратов растворами с различной концентрацией красителя, меняя длительность его воздействия. При приготовлении растворов необходимо учитывать рН воды: она должна быть нейтральной (pH 6,8 -7,2), что обеспечивается использованием буферных растворов. 3. Рекомендуемые методы окрашивание цитологических мазков: - азур-эозиновый, (по Романовскому, Лейшману, Май-Грюнвальду, Панпенгейму и др.); - гематоксилиновый; - гематоксилин-эозиновый; - метод Папаниколау. 4. Для уточнения диагноза рекомендуется использование цитохимических и иммуноцитохимических методов анализа в соответствии с принятыми методиками...." P.S. И все таки забавный способ..."сортинг на слайде".. Может лучше на бидзах отсортировать нужные клетки, а потом их- на морфологию? Чище будет.
|
Дядя ФАКСер Постоянный участник Nothern Maccaronia, Ticinum |
"...Для получения мазка в виде монослоя угол наклона следует уменьшить до 16°, скорость движения замедлить до 2 сек., каплю крови уменьшить до 3 мкл. После приготовления мазки следует быстро высушить на воздухе до исчезновения влажного блеска, что позволит избежать сморщивания и смывания их со стекла во время фиксации. При медленном высыхании может изменяться морфология клеток крови. Препараты фиксируют сразу после высушивания на воздухе. Если использовался антикоагулянт, то нужно помнить, что несоответствие концентрации антикоагулянта объему взятой крови, недостаточно тщательное смешивание могут привести к серьезным ошибкам, в том числе повлечь за собой неточное определение концентрации клеточных элементов, искажение морфологической структуры клеток. ..." |
Дядя ФАКСер Постоянный участник Nothern Maccaronia, Ticinum |
Вот тут подробности: |
Manskikh |
(Дядя ФАКСер @ 09.04.2009 14:35) Cушат затем, чтобы хорошо отфиксировались и окрасились, только и всего. Может лучше на бидзах отсортировать нужные клетки, а потом их- на морфологию? Чище будет. Ооо, видно, что не морфолог и не врач писал. ))))))) Лишнее это, на мазках все проще гораздо, дешевле и удобнее. И привычнее. Вы, конечно, со своей любовью к сортингу посоветуете и патоморфологам не срезы ИГХ-ить, а дробить ткань опухоли на клетки - и на ФАКС ))))))) Автору - скажите, а вам Май-Грюнвальд не мешает потом? Все-таки это уже не только фиксатор, но еще и краска. На одном русском патанатомическом форуме, если не ошибаюсь, писали (могу поискать ссылку, если ОЧЕНЬ надо), что, например, после Романовского-Гимзы (если обесцветить) ИЦХ не катит никаким боком. И фиксация вроде ацетоновая нужна, а не метанольная. И что значит - "выплевывают цитоплазму"?!!! (фиксированные клетки???!!!) Поясните, как это выглядит. Я наделал и пересмотрел несчетные тысячи разных мазков, но не представляю, о чем вы говорите... Что касается фиксации - дело в том, что спирт очень грубо коагулирует белки (и плазмы, и клеток) во влажных мазках. Попробуйте как-нибудь - и сами поймете, о чем я говорю. Мазок будет как белесая пленка, которая еще и отваливается местами. И микрокартинка соответствующая. Есть, правда, старые способы фиксации именно влажных мазков. Их использовали древние цитологи, когда не было электронной микроскопии, чтобы всякие клеточные тонкости смотреть. Чаще всего фиксировали в парах осмиевой кислоты, реже - формалина. Либо опускали влажный мазок в смесь Ценкер-Максимова. Сообщение было отредактировано Manskikh - 10.04.2009 18:48 |
Manskikh |
(Дядя ФАКСер @ 09.04.2009 14:35) - гематоксилиновый; - гематоксилин-эозиновый; Ни-ни-ни! Только Гимза-Паппенгейм-азур-эозин! Совершенно другая, непривычная картина структур клеток получается при окраске гематоксилин-эозином, множество деталей (азуровые зерна, палочки Ауэра и мн.др.) не видно. Папаниколау тоже не в ту степь. Его впервые предложили для окраски гинекологических мазков, при скрининге рака матки (кстати, кто не знает - за методику автор на Нобеля выдвигался). Сообщение было отредактировано Manskikh - 10.04.2009 23:58 |
Дядя ФАКСер Постоянный участник Nothern Maccaronia, Ticinum |
(Manskikh @ 10.04.2009 17:18) Ооо, видно, что не морфолог и не врач писал. ))))))) Лишнее это, на мазках все проще гораздо, дешевле и удобнее. И привычнее. Вы, конечно, со своей любовью к сортингу посоветуете и патоморфологам не срезы ИГХ-ить, а дробить ткань опухоли на клетки - и на ФАКС ))))))) Именно так, мой юный друг: дробить- и на FACS. Ибо глаза ломать на микроскопе- некошерно. P.S. Ну а коли морфология - так ссылки дал (чтобы все сразу делать) Stream-imaging |
Manskikh |
(Дядя ФАКСер @ 13.04.2009 23:30) Ну-ну, я же говорю - вы такой старый, а до сих пор ни разу не патоморфолог Неужели вы не представляете разницу между срезом и суспензией... ??? Не верю-c... Например, поставьте-ка стадию меланомы по ФАКСовой суспензии Если без злых шуток - гистологию еще очень долго ничто не заменит и в микроскоп смотреть придется. Важно ведь не только знать, сколько каких клеток в данной ткани, но к каким именно тканевым структурам они принадлежат и где эти структуры находятся, а сие видно только на ИГХ. "Вкусный метод" облегчит жизнь только гематологам и (maybe) цитологам, а не патологоанатомам. Сообщение было отредактировано Manskikh - 13.04.2009 23:53 |
Дядя ФАКСер Постоянный участник Nothern Maccaronia, Ticinum |
(Manskikh @ 13.04.2009 22:17) Оно мне надо? Я вообще- не врач (Manskikh @ 13.04.2009 22:17) Если без злых шуток - гистологию еще очень долго ничто не заменит и в микроскоп смотреть придется. Важно ведь не только знать, сколько каких клеток в данной ткани, но к каким именно тканевым структурам они принадлежат и где эти структуры находятся, а сие видно только на ИГХ. "Вкусный метод" облегчит жизнь только гематологам и (maybe) цитологам, а не патологоанатомам. Вот тут все верно. Просто изначально речь шла именно о гематологических образцах, а не срезах. |
Дядя ФАКСер Постоянный участник Nothern Maccaronia, Ticinum |
|
Sonya Kuznetsova Постоянный участник |
(Manskikh @ 10.04.2009 19:18) скажите, а вам Май-Грюнвальд не мешает потом? Пока "потом" ничего не предполагается, кроме как посмотреть морфологию. Мы 2 варианта окраски пробовали, Май-Грюнвальд + докраска азур-эозином и фиксация метанолом-сушка-Гимза. Если ИЦХ после Гимзы не получается, очень полезно это знать, так что если вдруг найдется ссылка - в ножки поклонюсь. (Manskikh @ 10.04.2009 19:18) И что значит - "выплевывают цитоплазму"?!!! Поясните, как это выглядит. Я имела в виду клетки, у которых нет четкой, как в мазках, границы цитоплазмы. Ядро нормальное, а граница клетки в "протуберанцах", и синий цвет цитоплазмы постепенно сходит к границе на нет. Вторая беда - когда клетки съеживаются. Тут дело, видимо, в слишком медленном высыхании. В тонком мазке все сохнет мгновенно, а когда клетки связались с антителами на поверхности, и потом неспецифику отмыли буфером, на поверхности, как ни стряхивай, остается довольно много буфера, и сохнет он долго. Поэтому и был вопрос, что будет, если не сушить. В мазках ни того, ни другого я тоже не вижу. Файл/ы:
|
Oleg Klychnikov Постоянный участник Moscow/Amsterdam->Leiden |
|
Manskikh |
(Sonya Kuznetsova @ 14.04.2009 22:31) Я имела в виду клетки, у которых нет четкой, как в мазках, границы цитоплазмы. Ядро нормальное, а граница клетки в "протуберанцах", и синий цвет цитоплазмы постепенно сходит к границе на нет. Вторая беда - когда клетки съеживаются. Тут дело, видимо, в слишком медленном высыхании. В тонком мазке все сохнет мгновенно, а когда клетки связались с антителами на поверхности, и потом неспецифику отмыли буфером, на поверхности, как ни стряхивай, остается довольно много буфера, и сохнет он долго. Поэтому и был вопрос, что будет, если не сушить. В мазках ни того, ни другого я тоже не вижу. Спасибо за картинки. По-моему, не только цитоплазма повреждена (это можно вполне назвать "лизисом"), но и ядро довольно пикнотично. Кроме того, вас не смущают эти биполярные dark blue rods (очевидно, бактерии) на первом снимке? Не зная ваших условий, попробую порассуждать абстрактно. Когда я видел такие клетки? Прежде всего, когда материал перед исследованием долго содержался в нефиксированном состоянии (в особенности, если он контаминирован бактериями). Например, похожая картинка бывает в мазках из плевральной жидкости мышей, павших от спонтанной лимфомы (как вы понимаете, от момента гибели животного до момента обнаружения и вскрытия трупа проходит некоторое время) или если материал (кровь, экссудат, костный мозг и т.д.) хранился некоторое, довольно значительное время до приготовления мазка (точно сказать, сколько – нельзя, зависит от температуры и от среды). Наличие бактерий (если они, конечно, не занесены с реактивами при обработке мазка) говорит за такую возможность. Еще вариант – на каком-то этапе обработки нефиксированные клетки оказались в неадекватных осмотических услових. Тоже бывают похожие картинки. Продумайте, не могло ли это произойти, в том числе и при приготовлении мазка (неравномерном подсыхании). Очень возможно, что здесь именно неравномерно подсыхающий буфер виноват (адгезируете нефиксированные клетки?). Таким образом: длительное хранение материала (или любая длительная процедура с материалом) до момента изготовления мазка и фиксации либо нарушение осмотических условий среды, где находились нефиксированные клетки. Вот все, что я имею сказать по этому делу. Ссылку про ИЦХ и Гимзу поищу. Только - то не статья, а просто вот обсуждение на форуме. Сушить (аккуратно сдувать жидкость) в потоке воздуха - создаваемого резиновой грушей, например - не пробовали? Сообщение было отредактировано Manskikh - 15.04.2009 08:48 |
Manskikh |
(Дядя ФАКСер @ 14.04.2009 15:55) Скажем так - очень полезным |
Guest IP-штамп: fr4MbcymAiCcU гость |
(Manskikh @ 14.04.2009 23:15) Очень возможно, что здесь именно неравномерно подсыхающий буфер виноват (адгезируете нефиксированные клетки?). Клетки адгезируются живыми, потом "лишние" смываем буфером, а потом уже подсушиваем, фиксируем и красим. Дуть прямо на клетки не пробовали, но сушили образцы вертикально под включенной вытяжкой. Это помогает, но недостаточно. Длительного хранения материала не было, так что бактерии попали из реактивов, наверное В процессе выделения/инкубации клеток все изоосмотично, но вот при сушке осмотичность неизбежно нарушится, потому что вода из буфера испаряется, а соль остается. Поэтому опять-таки сушить нужно быстро. Знающие люди предложили в метанол быстро окунуть прямо после отмывки, а потом уже красить как обычно. Что Вы про это думаете? |
Sonya Kuznetsova Постоянный участник |
(Manskikh @ 14.04.2009 23:15) Очень возможно, что здесь именно неравномерно подсыхающий буфер виноват (адгезируете нефиксированные клетки?). Клетки адгезируются живыми, потом "лишние" смываем буфером, а потом уже подсушиваем, фиксируем и красим. Дуть прямо на клетки не пробовали, но сушили образцы вертикально под включенной вытяжкой. Это помогает, но недостаточно. Длительного хранения материала не было, так что бактерии попали из реактивов, наверное В процессе выделения/инкубации клеток все изоосмотично, но вот при сушке осмотичность неизбежно нарушится, потому что вода из буфера испаряется, а соль остается. Поэтому опять-таки сушить нужно быстро. Знающие люди предложили в метанол быстро окунуть прямо после отмывки, а потом уже красить как обычно. Что Вы про это думаете? |
Manskikh |
(Sonya Kuznetsova @ 15.04.2009 12:24) А что значит "пикнотичное" ядро? Отчего такое бывает? Длительного хранения материала не было, так что бактерии попали из реактивов, наверное В процессе выделения/инкубации клеток все изоосмотично, но вот при сушке осмотичность неизбежно нарушится, потому что вода из буфера испаряется, а соль остается. Поэтому опять-таки сушить нужно быстро. Знающие люди предложили в метанол быстро окунуть прямо после отмывки, а потом уже красить как обычно. Что Вы про это думаете? Дуть струей воздуха на невысохший нефиксированный мазок, разумеется, нельзя ни в коем случае, я имел ввиду сушку препаратов после окраски. Пикнотичное - от слова "пикноз", гиперконденсация ядерного хроматина, ядро много темнее и плотнее обычного. Значит, что клетка помирать собралась. То, что вы рассказали, полностью проясняет картину. У меня такое было - целую серию загубил - когда готовил препараты из суспензионной культуры ФГА-стимулированных спленоцитов (в одной умной забугорной иммунологической книжке - не буду говорить, в какой - писали, что, мол, так можно), делая мазки из взвешенных в среде клеток. Среда подсыхала неравномерно, местами образовывались микроскопические кристаллы соли, клетки разрушались и были похожи на ваши, и даже еще хуже. Но в моем случае проблема решалась просто - надо клетки открутить, убрать культуральную среду и заменить на сыворотку, а потом уже из этой взвеси делать мазки. Не знаю, как поступить в вашем случае. Может, отмывать раствором альбумина на буфере или смесью буфера с сывороткой (причем сыворотки должно быть много, никак не менее 50%)? Сырой мазок отмытых от белков плазмы клеток в метанол никогда не совал. Попробуйте. Вряд ли будет хуже, чем уже есть. Сообщение было отредактировано Manskikh - 16.04.2009 04:28
|
Sonya Kuznetsova Постоянный участник |
(Manskikh @ 15.04.2009 21:39) Может, отмывать раствором альбумина на буфере или смесью буфера с сывороткой (причем сыворотки должно быть много, никак не менее 50%)? А 10% сыворотки + 1% альбумина (стандартный вариант) не хватит? Я как раз собиралась такой вариант попробовать... |
Manskikh |
(Sonya Kuznetsova @ 16.04.2009 11:27) А 10% сыворотки + 1% альбумина (стандартный вариант) не хватит? Я как раз собиралась такой вариант попробовать... Попробовать можно, конечно. У меня, правда, в культуральной среде (в которой клетки портились при высыхании) 15% феталки было... И вот еще что - находятся ли клетки в бессывороточной среде (в процессе инкубации, например) и, если да, то как долго? Сообщение было отредактировано Manskikh - 16.04.2009 19:02 |
Guest IP-штамп: frZjFl7heAmvM гость |
|
HumukB |
|
« Предыдущая тема · Классическая биология · Следующая тема » |