Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
ПеченьКо IP-штамп: frdk4fFh7od4A гость |
Заранее благодарю. |
petr Постоянный участник |
Кстати, SAM нестабилен, разальквотьте и исрользуйте по одному разу. |
semi Постоянный участник Москва |
|
ПеченьКо IP-штамп: frdk4fFh7od4A гость |
|
ПеченьКо IP-штамп: frdk4fFh7od4A гость |
|
semi Постоянный участник Москва |
|
akatar |
Если у Вас бисульфитное сиквенирование, и такой вот участок локальной неконверсии окажется в зоне прочтения, между праймерами - то по сиквенсу его будет видно, по неконвертированности С, которые не в CG-сайтах. Если интересующие Вас CG-сайты лежат за пределами этого участка, и вблизи них с конверсией все в порядке - то этой локальной неконверсией можно спокойно пренебречь. Если вам все-таки надо определить статус тех CG-сайтов, которые попадают на этот участок неконверсии - то можно побороться с проблемой: 1)порезать ДНК подходящими рестриктазами, чтобы облегчить ее денатурацию; а если получится, то и отрезать часть самой шпильки 2) ужесточить условия конверсии: более жесткую денатурацию, удлинить время конверсии. В частности, можно вести конверсию в термоциклере, по схеме с периодическими нагревами. Что-то вроде: "95 - 3-5 мин (первичная денатурация ДНК)", и затем от 10 до 30 циклов типа "95 - 1-2 мин, Т(конверсии) - 10-15 мин". Периодические нагревы до 95 временно раскрывают шпильки, - и появляется шанс, что прежде чем она захлопнется обратно при остывании до Т(конверсии), какой-то из С в ней успеет прореагировать, комплементарность в шпильке будет частично нарушена, и дальше дело с ней пойдет проще. И соответственно, чем дольше идет сама конверсия, тем и вероятность такого события выше. Однако переусердствовать с этими нагревами и с общей продолжительностью конверсии тоже не стоит, чтобы не снизить выход реакции из-за деградации ДНК образца. В общем, надо подобрать некую оптимальную программу конверсии под свои конкретную ДНК. Прикинуть, есть ли в зоне прочтения нехорошие шпильки при температуре конверсии можно по програмке mfold (http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold/DNA-Folding-Form) Если на участок локальной неконверсии попадает один из ваших сиквенсных праймеров - то может быть такая проблема, что конвертируете вы ДНК, пытаетесь наработать с нее ПЦР-продукт для бисульфитного сиквенирования - а он не нарабатывается, и все тут. А позитивного контроля для ПЦР нету, и возникает дилемма: то ли плохая конверсия, то ли плохие праймеры и условия ПЦР. Начинаете улучшать конверсию, проверять ее по бисульфитному сиквенсу других районов - а там все вроде в порядке, конверсия везде качественная... Пытаетесь оптимизировать ПЦР - а искомого продукта все нет. Пытаетесь чуть подвигать праймеры (причем двигаете или не тот праймер, или тот, но в пределах участка неконверсии...) - все по нулям. Да и сильно не подвигаешься: CG-сайты густо стоят, между ним не впишешься, да и длинный продукт (более 350 bp) для бисульфитного сиквенирования делать нежелательно. Такая вот может выйти патовая ситуация из-за одной недоучтеной шпильки, дающей локальную неконверсию. Способы борьбы тут, собственно, те же: поглядеть по mfold, есть ли опасные шпильки; и если есть - подбор рестриктаз для вырезания оптимального фрагмента из ДНК, и ужесточение условий конверсиии. Могут быть еще минимум две причины, почему с конвертиованной ДНК не нарабатывается продукт для бисульфитного сиквенирования: 1) полиморфизм, реальная пследовательность в образце не соответствует той, по какой подбирали праймеры. Это если что, по обычному сиквенсу можно увидеть. 2) шпильки на конвертированной ДНК: она хоть и вырожденная и легкопавкая, и тугоплавкие вторструктуры на ней редко встречаются - но встречаются (в частности из-за образующихся в результате конверсии длинных блоков А-Т). И попади такая шпилька на праймер или между праймерами - и ПЦР с конвертированной ДНК может и не пойти, при том, что и конверсия качественная, и с самими праймерами все в порядке. Так что и конвертированную ДНК есть смысл глядеть по mfold, по крайней мере при наличии проблем с ПЦР. Ну а как бороться с этим - можно повышать Т(отжига) чтоб попытаться расплавить шпильку (но праймеры для конвертированной ДНК обычно легкоплавкие, особо не поповышаешь); удлиннить период элонгации, чтоб дать полимеразе время таки проехать через шпильку; с присадками к ПЦР поиграться. Однако не факт, что борьба эта в итоге не закончится убедительной победой шпильки... Сообщение было отредактировано akatar - 25.03.2013 18:05
|
ПеченьКо IP-штамп: frdk4fFh7od4A гость |
|
akatar |
И заодно уж еще один умный вещь скажу по поводу бисульфитного сиквенса, а то это порой как-то упускается из виду: ведь после бисульфитной конверсии смысловая и антисмысловая цепь исходной ДНК представляют собой довольно-таки различающиеся последовательности, но с одинаковыми позициями CG-сайтов. В смысловой идет замена С на Т, как положено; а вот если посмотреть, в такой же ориентации, на комплементарку к конвертированной антисмысловой цепи - то там-то получается замена G на A, а по CG-сайтам соответственно - либо CG для метилированных, либо CA для неметилированных. Т.е. - это две разные последовательности, шпильки и позиции праймеров у них довольно сильно различаются. (для работы можно антисмысловую цепь развернуть в 3' - 5' ориентацию, и работать как обычно, с заменами С на Т) Соответственно, это дает полезную дополнительную возможность: если та картина, что по вариантам праймерав и по шпилькам вырисовывается для конвертированной смысловой цепи, сильно не нравится, или подобранные к ней праймеры не работают, хоть убейся - то можно попробовать подобрать праймеры к конвертированной антисмысловой цепи, возможно там все окажется получше. А вообще же, при подборе праймеров для бисульфитного сиквенса лучше сразу смотреть оба варианта, сенсный и антисенсный, и выбирать, какой выглядит более благоприятным. Сообщение было отредактировано akatar - 02.04.2013 14:40 |
Annie07 |
Проясните, пожалуйста, пару моментов по поводу бисульфитной конверсии и секвенирования: 1)При конверсии с использованием наборов QIAGENE и др. неметилированный С конвертируется в U. В базовой статье, на которой я основываюсь при постановке эксперимента, указывается, что далее они конвертировали цепь до Т. Насколько критична эта стадия?Можно ли без нее обойтись? Будет ли полимераза распознавать U, как Т?Сядут ли праймеры предназначенные для Т, на ту цепь, которая несет U. 2)Можно ли провести бисульфитное секвенирование без предварительного клонирования?Для чего нужно клонировать фрагмент? |
plurgene Постоянный участник |
|
watchesbiz Постоянный участник |
|
watchesbiz Постоянный участник |
|
nigoal123 IP-штамп: frpXPq5TOmUHs гость |
thought leadership while |
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |